Аналог энкефалина, обладающий анальгетической активностью
Изобретение касается производных пептидов, в частности аналога знкефалина формулы Tyr-D- grn Gly Phe Изобретение относится к аналогу энкефалина I Туг - D Огп - Gly - Phe - NH Arg - Asn-l, новому биологически активному соединению , обладающему анальгетической активностью, которое может найти применение в медицине. Цель изобретения - поиск в ряду пептидов-аналогов анквфалинов, обладающих низкой токсичностью и более высокой анальгетической активностью Описываемый аналог энкефалина (смосхену на чертеже), синтезируют известными методами пептидной химии в растворе, согласно приведенной схемы с использованием активированных эфиров трет-бутилоксикарбониламиноNH , который обладает биологической активностью и может найти применение в медицине Цель создание более активных веществ указанного класса. Получение ведут с использованием активированных зфиров третбутилоксикарбониламинокислот с защитой аминогрупп. Испытания показьшают, что новый аналог энкефалина малотоксичен и при внутреннем введении в 1,5 раза активнее морфина, в 3 раза активнее аналога: ()-- , а при интрацистернальном введении мышам - в 3 раза активнее морфина,в 12,5 раз активнее аналога. 1 ил. 2 табл. кислот. J-Аминофункцию Б орнитина защищают бензилоксикарбонильной группой, гидроксил тирозина трет-бутилоксикарбонильной группой. Установлено, что амидирование карбоксильной группы в гексапептиде приводит к неожиданному резкому увеличению анальгетической активности полученного нового аналога энкефалина как при интрацнстернальном,так и при внутривенном введении в опытах на животных Для синтеза аналога энкефалина (I) используют аминокислоты и их производные фирмы Реанал (Венгрия). Все аминокислоты, кроме D-орнитина, имеют L-конфигурацию. Температуру плавления веществ определяют в капилляре (без коррекции). Индивидуальность промежуточных соединенит контролируют с помощью тех на пластинS М ш,
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСГ1УБ ЛИК
u% (и) А1
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 3997685/31-04 (22) 04,10,85 (46) 23,03,90, Бюл. 11 (71) Институт органического синтеза
АН ЛатвССР (72) И,В.Боброва, Г.И,Чипенс, Н.A,Àáèññîâà и И.И.Гейман (53) 547.964.4(088,8) (56) Авторское свидетельство СССР
1182796, кл. С 07 К 7/06, приоритет
31.01.84. (54) АНАЛОГ ЭНКЕФАЛИНА, ОБЛАДАЮЩИЙ
АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Изобретение касается производных пептидов, в частности аналога энкефалина формулы Tyr-D" "l
Изобретение относится к аналогу энкефалина формулы Х
Tyr - D 0m — Gly — Phe — NH<
Azg - Asn новому биологически активному соединению, обладающему анальгетической активностью, которое может найти применение в медицине.
Цель изобретения — поиск в ряду пептидов-аналогов внкефалинов, обладающих низкой токсичностью и более высокой анальгетической активностью.
Опись".ваемый аналог энкефалина (cM.ñõåìó на чертеже), синтезируют известными методами пептидной химии в растворе, согласно приведенной схе" мы с использованием активированных эфиров трет-бутилоксикарбониламиноЩ)З С 07 К 7/06, 7/12 А 61 К 37/02
NHq Arg Asn, который обладает биологической активностью и может найти применение в медицине. Цель — создание более активных веществ указанного класса. Получение ведут с использованием активированных эфиров третбутилоксикарбониламинокислот с защитой аминогрупп. Испытания показывают, что новый аналог энкефалина малотоксичен и при внутреннем введении в
1,5 раза активнее морфина, в 3 раза активнее аналога: Tyr-П-Огп(Аг@ Asn)-С1У-РЬе, а при интрацистернальном введении мьппам — в 3 раза активнее морфина,в 12,5 раз активнее аналога.
l ил. 2 табл. кислот. 3 -Аминофункцию D-opea vaa sa- 2 щищают бензилоксикарбонильной группой, гидроксил тирозина трет-бутилоксикарбонильной группой. Установлено, что амидирование карбоксильной группы в гексапептиде приводит к неожиданному резкому увеличению анальгетической активности полученного нового аналога энкефалина как при интрацистернальном,так и при внутривенном введении в опытах на животных.
Для синтеза аналога энкефалина (Х) используют аминокислоты и их производные фирмы "Реанал" (Венгрия).
Все аминокислоты, кроме D-орнитина, Ь. I имеют L-конфигурацию. Температуру плавления веществ определяют в капилляре (без коррекции), Индивидуальность промежуточных соединени."1 контролируют с помощью TCX на пластин 341970 ках "Silufol П17 " (ЧССР),. Для хроматографии аналога энкефалина используют стеклянные пластинки с закрепленным слоем силикагеля "Ях1Жа Gel 60
Р-254" фирмы "Merck" (ФРГ) н следугощих системах: хлороформ — этанол— уксусная кислота (АсОН), 85:10:5 (A); н-бутанол-пиридин-АсОН-Н О„ 30:20:4:6 (Д), Удельное оптическое вращение пептидов измеряют на поляриметре
"Perkin-Elmer 141И" (ФРГ),. Кислотный о гидролиз проводят при 120 С н тече-. ние 24 ч. Аминокислотншй состан апре" деляют на анализаторе " Jed-31 . Для всех соединений данные элементного анализа удовлетворительно совпадают с вычисленным содержанием С, Н, 11.
Пример. N-трет-Бутилоксикарбонил-глицил-фенилаланин (7). 20
6,6 г (40 ммоль) 1.-фенилаланина растворяют в 40 мл н. раствора гидроокиси натрия, добавлчют 3,34 г бикарбопата натрия, 50 мл диметилформамида (ДМФА) и 16,94 г (40 ммоль) 25 пентахлорфенилового эфира трет-бутил" оксикарбонил-глицина, растворенного в 20 мл ДМФА. Смесь перемешивают в течение нескольких часов, После завершения реакции (хроматографический 30 контроль) реакционнуго массу разбавляют этилацетатом и водой (до разделения слоев), охлаждают до 0 Ã и под-кислягот 0,5 н,. соляной кислотой до рН 3, Зтилацетатиый слой отделяют, водную фазу экстрагируют повторно.
Объединенный этилацетатный слой ;ромывагот водой, насыщенным раствором хлористого натрия и сушат над безводным сульфатом натрия. Кристалличес-,л0 кий осадок, полученный после отгонки растворителя, перекристаллизовывают из этилацетата с небольшой добавкой петролейного эфира. Выход дипептида (7) 11,4 г (88%); т,пл, 133-135 С:
t И -трет-бутилоксикарбонил, N— бензипоксикарбонпгг-D-орнитилглицил-. фенилаланин (9,)Ä 10,:;: г (-3,8 ммоль) дипептида (7) растворяют в 50 мл 70%-ного раствора трифторуксусной кисг лоты (ТГЛ) н дихлорметане и вьгдержива:"-. ют 30 мин, Рас. .воритель отгоняют, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают, промывагот эфиром на фильтре и сушат н вакууме над гидроокисью калич„ Получают 10„4 г (91% )трифторацетата дипептица (8); Б1 0,63 (Д)5,2 г (15,5 ммоль) трифторацетата (8) растворяют в 50 мл ДМФА, охлажда. ют до О С и„при охлаждении добавляют 2,65 мл (15,5 г.гглоль) диизопропилэтиламина в 5 мл ДМФА и 8,2 г (15,5 ммоль) б. пентафторфе эфира N "третбутилоксикарбонил, N -бензилоксикарбонил-D-орнитина, растворенного в 15 мл ДМФА. Реакционную массу перемешивают несколько часов и после завершения реакции обрабатывают аналогично соединениго 7, Продукт, полученный после отгонки растворителя, очищают на колонке с силикагелем фирмы "Merck". Элюирование проводят в системе хлороформ — этанол — этилацетат-АсОН-Н О 285:5:8:2:0,25. Соответствующие фракции собирают, упаривают и сушат в вакууме. Получают 5,9 г (67%) масла защищенного трипептида (91 с R< 0,65 (А), 0,72 (В), N,0-ди-трет-бутилоксикарбонил-ти8 розил-N --бенэилоксикарбонил-D-орнитил-глицил-фенилаланин (11), 20,0 г (35 ммоль) трипептида (9) растворяют н 100 мл 50%-ного раствора ТГА в дихлорметане и выдерживают в течение 20 мин, Растваритель отгоняют„ остаток растирают с эфиром. Образовавшийся осадок отфильтровывают, нновь HpoMbIBGJoT эфиром и высушивают в вакууме над гидроокисью калия, Получают 19,2 r (94%) трифторацетата трипептида (10); 21 0,62 (Д) . 18,1 г (31 ммоль) трифторацетата трипептида (1О) растворяют н 100 мл о ДЕФА, охлаждают до 0 С, добавляют при перемешивании 5,3 мл (31 ммоль) диизопропилэтиламина в 10 мл ДИФА и l6,6 г .(31 ммоль) пентафторфенилового эфира N,О-ди-Вос-L-тирозина. Реакционную массу перемешивают 1,5-2 ч (хроматографический контроль) и после завершения реакции обрабатывают аналогично соединению 7, Продукт, полученный после отгонки этилацета-.a, размешивают с эфиром и охлаждают, Выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат з эксикаторе Выход.-16,0 г (63%) зацищенного тетра". иептида (11); R 0,75 (А); 0,55 (В, " Иеген"); г. N 0-yv-трет-бутилоксикарбонил-тирозил-N -(М-бензилоксикарбониласпарагинил)-D-орнитил-глицил-фенилаланин (13)„ К 18 г (22 ммоль) защищенного тетрапептида (11) в 150 мл 41970 5 13 метанола, 15 мл АсОН и 20 лл Н О добавляют палладиевую чернь и гидрируют в течение нескольких часов, Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают, Остаток растирают с эфиром и фильтруют, затем дважды переосаждают из спирта эфиром, вновь промьтвают эфиром и сушат в вакууме над гидроокисью калия. Получают 13,8 г (91/) тетрапептида (12); Ri 0,15 (A) 0,72 (Д, "Merck"); 0,77 (С, "Merck"). 5,1 п (6,8 ммоль) тетрапептида (12) растворяют в 100 мл дМФА и при перемешивании и охлаждении добавляют 1,16 мл (6,8 ммоль) диизопропилэтиламина в 3 мл ДМФА и 3,3 г (6 8 ммоль) нитрофениловогG эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспарагина, растворенного в 15 мл ДМФА. Через 2-3 ч реакционную массу обрабатывают аналогично соединению 7, Продукт, полученный после отгонки рас.творителя, очищают на колонке с силикагелем фирмы "Merck". Злюирование проводят, в системе хлороформ — этанол — этилацетат — АсОН-Н О 185:5:8:2:0,25. Соответствующие фракции собирают, упаривают и сушат в вакууме, Получают 4,6 г (70 ) разветвленного пентапептида энкефалина (13) с ( 1,69 r (2, 28 моль) пентафторфенилового эфира трибензилоксикарбонил-L-аргинина получают гексапептид (15) аналогично соединению (13). Очистка продукта, полученного после отгонки растворителя, не проводится ввиду плохой растворимости полученного соединения. Выход 2,7 г защищенного гексапептида (15). N 0-ди-трет-бутилоксикарбонил- ти2 розил-(И -(трибензил-оксикарбониларгинил-аспарагинил)) -D-орнитил-глицилфенилаланинамид (16). К раствору 0,514 г (0,373 ммоль) соединения (15) г, 10 мл ДМФА добавляют 0,050 г (0,373 ммоль) аммониевой соли 1-оксибензотриазола и 0,076 г (0,373 имоль) дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК). Реакционную смесь оставляют «Ia ночь, После завершения реакции реакционную массу отфильтровывают и обрабатывают аналогично соединению 7, Получают 0,352 г (683) защищенного амида гексапептида (16); К О, 75 (А) . Вследствие nëîõîé растворимости хроматографическую очистку соединения (16) не проводят, Тирозил-N -(аргинил-аспарагинилП-орнитил-глицилфенилаланинамид (1), K раствору 0,35? г (О,256 ммоль) защищенного гексапептида (16) в 15 мл метанола, 1,5 мл АсОН и 0,5 мл воды добавляют палладиевую чернь и гидрируют в течение 2-3 ч, Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают, Остаток растирают с эфиром и cymar в вакууме над гидроокисью калия. Полученный продукт растворяют в 5 мл /О -ного раствора ТГА в хлористом метилене и выдерживают 30 мин, Растворитель отгоняют и остаток растирают с эфиром, Образовавпийся осадок отфильтровывают,.промывают эфиром и сушат в вакууме. Полученный продук" очищают высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке "LогЬах С ", Элюирование осуществляют смесью этанол — 0,1 M раствор ацетата аммония 5:95. Соответствующие фракции собирают и лиофилизуют. Выход 0,076 г (ЗЯХ) разветвленного амида гексагептида (1) .с PWJ +45 (с. 1„ 0,2 н-AcÎH); R 0,43 (В, "Merck") 0,21 (Д, "Merck"); аминокислотный состав: Tyr 0,93; Г1у 1,00Ä Рпе 1,07; 0m 0,97; Asn 1,03; Arg 1,00. Биологическая активность описываемого энкефалина исследована в опытах in vivo по методу Уэда на беспородных мышах-самцах массой 18-22 г. Анальгетический эффект изучен по сравнению с таковым морфина, природHbIx энкефалинов (Leu- и Met:-знкефалиHGB) структурного аналога описываемого энкефалина, При интрацистернальном введении исследуемые соединения, растворенные в стерильном физиологическом растворе, в объеме 10 мкл вводят при помощи 3-образной иглы в с1з егпа тапяа мозга неанестезированным мышам. Исследовали диапазон доз от 0„0005 до 0,01 мкг/животное. Контрольным живот ным вводят 10 мкл стерильного физиологического раствора, При внутривенном введении препарат вводят в хвостовую вену мышей в диапазоне доз от 5 до 20 мг/кг массы животного, Каждая экспериментальная группа состоит из 10 мьппей, Анальгетический эффект 1341970 Аналог энкефалина формулы Tyr-D-Огп-01у-Phe-ИН Arg-Азп обладающий анальгетической активностью. Таблица 1 Анальгетическая активность аналогов энкефалина при интрацистернальном введении мышам (метод tail pinch) 1 ь Относительная анальгетическая акВ м тивность морфин=1 T yr-0-Огп-С1у-Phe-ЯН ,Е Arg Asn 7yr-D-Ог и-61 у-Phe Ах я-Азп (аналог-с равнение) : Leu-энкефалин Ne t -энк ефалин Ân-эндорфин 0,004(0,003 0,005) 5 300 0 05(0 03-0,10) 174 (102-281) 154 (90-261) 0,096(0,058-0,!57) О, 00? О, 008 5 15-30 соединений оценивают по тесту "tai pinch" при помощи артериального зажима, который накладывают на основание хвоста. Определение болевой. реакции проводилось через 5, 15 30, 60, 90 мин после введения и затем каждые 30 мин до исчезновения анальгетической реакции, Результаты выражают альтернативным 10 методом в проценте мышей, показавших анальгетическую реакцию. При вычислении ВД50 используют метод Литчфиль ца и Уилкоксона,,Анальгетическая активность и продолжительность действия 15 соединений приведены в табл.! и 2, 1 Новый аналог энкефалина проявляет выраженную анальгетическую активность. Максимальный эффект наблюдается на 5 мин .после введения. Как видно из табл.1, анальгетическая активность аналога энкефалина (1) при интрацистернальном введении мышам значительно превышает анальгетическую 25 активность природных энкефалинов (соединения 3, 4) и в 12,5 раз активность соединения 2 (аналога), Описываемое соединение 1 в 300 раз активнее морфина (соединение 6), в 25 раз 10 активнее природного длинного опиоидно" го пептида-В„-эндорфина (соединение 5) и в 3 раза активнее известного сильнодействующего аналога энкефалина FK-33-824 (соединение 7). В отличие от природных энкефалинов описываемое. соединение активно при внутривенном введении (таблица 2), Анальгетическая активность нового разветвленного,гексапептидамина 1 составляет 150Х активности морфолина при внутривенном введении, кроме того, он в 3 раза активнее аналога (соединение 2) при этом способе вве" дения. Терапевтический индекс нового соединения (1) составляет величину бо200 лее чем 18 (†-) поскольку дозы до 11 200 мг/кг {соединение 1) еще не вызывают каких-либо токсических эффектов или летального исхода при внутривен" ном введении, Таким образом, описываемое соединение 1 обладает выраженной анальгетической активностью, превосходя природные анальгетики и известные аналоги по структуре и при этом обладает низкой токсичностью. формула изобретения! 1341ИО Продолжение табл.1 Морфин Tyr-D-А1а-С1у-Ме Phe Ne t (0) l (FK 33-824) 1 1,2 (0,6-2)2) 0,013 П р и м е ч а н и е, ЕД д — эффективн я доза, вызывающая анальгетичес( кую реакцию у 50Х подопытных животных, В работе использовался морфин гидрохлорид в ампулах производства Ташкентского ХФЗ. ! Таблица 2 Анальгетическая активность аналога энкефалина при внутривенном введении мышам Продол кительность Время максимального эффекта "1> мин ЕД ), мкмоль/кг Соединение анальгезии мин ность (морфин 100X) 11,8(9-13) 5 151 35(25-50) 5 60 18(15-22) 5-15 60 100 i) Hp и м е ч а н и е. При ЕД в K Tyr D-0rrWly Phe-НН< Атg»»Aan Tyr-В-Огп-С1у-Phe Arg-Ава J Морфин Относительная анальгетическая актив 1341970 Редактор Л.Народная Техред М.Ходанич Корректор О.Кравцова Заказ 997 Тираж 3!9 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открьггиям при ГЕНТ СССР 113035, Москва, И-35, Раушская наб*р де 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101
