Аналог энкефалина, обладающий анальгетической активностью
Аналог энкефалина формулы Tyr-DOrn-Gly-Phe .Arg-Asn-J обладающий анальгетнческой активностью . (Л
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕаЪЬЛИН (1% (111 (g1)g С 07 К 5/10, 7/12, A 61 К 37/02!
:, ИЙ35И 1 (ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н А ВТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬС ГНУ!, функцию D-орнитина защищают бензил- (ф
-;оксикарбонильной группой, гидроксил ф тирозина — третбутилоксикарбонильной группой. Ж
Для синтеза предлагаемого аналога энкефалина используют аминокислоты и
"их производные фирюзы,"КеаааХ" (Венгрйя).
I .. -Ъ -
Все аминокислоты, кроме D-орннтййа, имеют L-конфигурацию. Температуру плавления веществ определяли в капилляре (без коррекции) . Индивидуальность промежуточных соединений контролировали с помощью ТСХ на пластинках "Siluf ol UV " (ЧССР) . Для хроматографии аналогов энкефалина применяли стеклянные пластинки с закрепленным слоем снликагеля "Silika Gel 60
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
1 (21) 3714613/23-04 (22) 31.01.84 (46) 07.10.90. Бюл. Р 37 (71) Институт органического синтеза
АН ЛатвССР (72) И.В.Боброва, Г.И,Чипенс и Н.А.Абиссова (53) 547.964.4.0?(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР
9 1116698, кл. С 07 С 103/52, 1982.
Buescher Н.Н. и др. "Evidense for:
analgesic activity of eukephalin in
the mouse", Nature, London 1976, 261, 423-425.
Kubota, M. и др. "Eukephalin.
anaiogs Containing the Dipeptide
unit Tyr-Arg (Keptorphin)" Chem.
Pharm. Bull. 1980, 28, 9 9> 25802586.
Изобретение относится к новому биологически активному соединению » аналогу энкефалина, обладающему анальгетической активностью, которое может найти применение в медицине.
Цель изобретения — поиск в области .пептидов — аналогов энкефалина, обладающих более высокой анальгетической активностью, чем известным природные энкефалины или их синтетические аналогие
Описываемый аналог энкефалина син тезируют известными методами пептидной химии в растворе согласно приведенной на чертеже схеме с использованием активированных эфиров трет-бутилоксикарбониламннокислот. $ -Амино2 (54) АНАЛОГ ЭНКЕФАЛИНА, ОБЛАДА10РЗЯЙ
АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Аналог энкефалина формулы
Туг-DOrn-Gly-Phe ,.Arg-Asn — 1 обладающий анальгетической активностью.
1182796. F-254" фирмы "bierk" (O I") ° Испольэова-, .ли следующие системы . растворителей; хлороформ » этанол -уксусная кислота (АсОН), 85:10:5 (А), и-бутанол-пирйдин — АсОН вЂ” Н О, 15:10:3:6 (В); . 15:12:3:IO (С)! хлороформ — метанол—
АсОН вЂ” Н О, 30:20:4:б (Д). Удельное оптическое вращение пептидов измеряют на поляриметре "Perkin Elmer 10 ! 4 . М" (ФРГ) . Кислотный гидролиз проводят при 120 С в течение 24 ч. Аминокислотный состав определяют на анализаторе "Jeol". Для всех соединений данные элементного анализа удовлетво- 15 .рительно совпадают с вычисленным со держанием С,Н,Н.
N-трет †бутилоксикарбон"глицилфенилаланин (4). б,б г (40 ммоль) L-фенилаланина 20 (2) растворяют в 40 мл 1 н. раствора гидрооккси натрия, добавляют 3,34 r бикарбоната натрия, 50 мл диметилформамида (ДМФА) и 16,94 r (40ммоль) пента лорфенилового эфира трет-бутил- 25 оксикарбонил-глицина (3), растворенного в 20 мл дМФА, Смесь перемешивают в течение нескольких часов. После завершения реакции (хромато1.рафический контроль) реакционную массу раз- 30 бавляют этилацетатом и водой (до разделения слоев), охлаждают до О С и подкисляют 0,5 н, соляной кислотой до рН 3. Этилацетатный слой отделяют, водную фазу экстрагируют повторно.
Объединенный этилацетатнь,й слой промывают водой, насыщенным раствором . хлористого натрия и сушат над безводным сульфатом натрия. Кристаллический осадок полученный после отгон- 40 ки растворителя, перекристаллизовывают их этилацетата с небольшой добавкой петролейного эфира. Выход дипептида (4). — 11,4 r (887), т.пл. 133135 С; Ы je + 15,7 (с 1, ДИФА); 45
К1 О, 73 (А), 0,80 (Д) .
N -трет-бутилоксикарбонил, Б— бензилоксикарбонил-D-орнитил-глицил- фенилаланин (7).
10,9 r (33,8 ммоль) дипептида (4) растворяют в 50 мл 707 раствора трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане и выдерживают 30 мин. Растворнтель отгоняют, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром на фильтре и сушат в вакууме над гидроокисью калия. Получают 10,4 г (9IX) трифторацетата дипептида (5), R 0,63 (Д).
5,2 г (15,5 ммоль) трифторацетата (5) растворяют в 50 мл ДМФА, охлаждают до 0 С и при охлаждении доо бавляют 2,65 мл (15,5 ммоль) диизопропилэтиламина в 5 мл ДМФА и 8,2 r (15,5 ммоль) пентафторфенилового эфира N -трет-бутилоксикарбонил, N -бенФ» 6 зилоксикарбонил-D-орнитина (6), растворенного в 15 мл ДМФА. Реационную массу перемешивают несколько часов и после завершения реакции обрабатывают аналогично соединению 4.
Продукт, полученный после отгонки растворителя, очищают на колонке с силикагелем фирмы "derek".„Элюирование проводят в системе: хлороформ— этанол — этилацетат -АсОН вЂ” Н О
285:5:8:2:0,25. Соответствующие фракции собирают, упаривают и сушат в вакууме.
Получают 5,9 r (677) масла защищенного трипептида (7) с Rf 0,65 (А).
0,72 (В).
N,0-ди-трет-бутилоксикарбонил-тирозил-N -бензилоксикарбонил-D-орнитил-глицил-фенилаланин (10).
20,0 r (35 ммоль) трипелтида (7) растворяют в 100 мл 507. раствора TFA в дихлорметане и выдерхжвают в течение 20 мин. Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром. Образовавшийся осадок отфильтровывают, вновь промывают эфиром и высушивают в вакууме над гидроокисью калия. Получают
19,2 r (947) трифторацетата трипептида (8) с Rf 0,62 (Д), l8 r (31 ммоль) трифторацетата трипептида (8) растворяют в 100 мп
ДМФА, охлаждают до 0 С, добавляют при перемешивании 5,3 мл (31 ммоль) диизопропилэтиламина в 10 мл ДМФА и 16,6 г (31 ммоль) пентафторфенилового эфира N 0-ди-Вос-L-тирозина (9).
Реакционную массу перемешивают 1,5-2 ч (хроматографический контроль) и после завершения реакции обрабатывают аналогично соединению (4), Продукт, полученный после отгона этилацетата, размешивают с эфиром и охлаждают. Выпавший. осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат в эксикаторе. Выход 16,0 г (637) защищенного тетрапептида (11) с Rf 0,75 (А), 0,55 (В, "Nerck ); Ы + 5,6 (с 1, ДМФА).
N-0-ди-трет-бутилоксикарбонил-тиро- . зил-N -(N-бензилоксикарбониласпарагинил)-D-орнитил-глицил-фенилаланин (12).
5 1182796 6
В 18 r (22 ммоль) зашищенного тет- в хлористом метилене и выдерживают рапептида (9) в 150 мл метанола, 30 мин. Растворитель отгоняют и оста15 мп АсОН и 20 мл Н О добавляют пал- ток растирают с эфиром. Образовавшийладиевую чернь и гидрируют в течение ся осадок отфильтровывают повторно
t нескольких часов. Катализатор отфильт- промывают эфиром и сушат в вакууме. ровывают, фильтрат упаривают. Оста- Полученный продукт очищают высокоэфток растирают с эфиром и фильтруют, фективной жидкостной хроматографией затем дважды переосаждают из спирта на колонке ZorbaxC . Элюирование осу8 эфиром, вновь промывают эфиром и су- 10 ществляют смесью этанол — 0,1 M растшат в вакууме над гидроокисью калия. вор ацетата аммония, 5:95. СоответПолучают 13,8 г (91 ) тетрапепти- ствующие фракции собирают и лиофилида (11) с Rf 0,15 (А), Ое72 (Д, зуют. Выход 220 мг (42 ) разветвленно"Merck",), 0,77 (C, "Merck"). го гексапептида энкефалина (1) с
5,1 г (6,8 ммоль) тетрапептида (11) 15 (60 + 33 (с, 1; 0,2 í. АсОН); Rf растворяют в 100 мл ДИФА и при пере- 0,32 (В, "Mezck"), 0,16 (Д, "Merck"); мешивании и охлаждении добавляют аминокислотный состав: Tyi 0,86;
1,16 мл (6,8 ммоль) диизопропилэтил- . Gly 1,00; Phe 0,92; Orn 0,93; Asn 0,93 . амина в 3 мл ДИФА и 3,3 г (6,8 ммоль) Arg Оэ79 ° нитрофенилового эфира.Я-бензилокси- 20 Биологическую активнось описываекарбонил-l-аспарагина, растворенного мого аналога энкефалина (l) исслев 15 мл ДИФА. Через 2-3 ч реакцион- дуют в опытах in viyo. Анальгетичесную массу обрабатывают аналогично со" кий эффект соединения (1) сравнивают единению (4). Продукт, послученный с таковым морфина, природного энкепосле отгонки растворителя, очищают 25 фалина и с известным аналогом энкефа- на колонке с силикагелем фирмы лина (по данным литературы).
Н .И
Merek . Элюирование проводят в сис- Анальгетическую активность опредетеме: хлороформ — этанол — этилацетат — ляют по методу Н.беда etal. Опыты проАсОН вЂ” Н О, 185:5:8:2:0,25. Соответ- водят на беспородных мышах-самцах ствующие фракции собирают, упаривают 30 массой 18"22 r ° Исследуемые вещества, и сушат в вакууме. Получают 4,6 r растворенные в стерильном физиологи(70 ) разветвленного пентапептида эн- ческом растворе, вводят при помощи кефалина (12) с Ы) + 8,2 (с l, I-образной иглы в asteana magna мозЯф О
ДЕФА); Ы 0,72 (А), 0,83 (Д). га неанестезированным мышам в количеN,0-ди-трет-бутилоксикарбонил- 3 стве 10 мкл. Исследован диапазон доз тирозил-Я -(три-бензилоксикарбонил- от 0,025 до 1,0 мкг на животное. Конаргинил-аспарагинил)-D-орнитил-гли- трольным животным вводят 10 мкл стецил-фенилаланин(14). рильного физиологического раствора.
Из 2 r (2,28 ммоль) пентапепти- При внутривенном введении препарат да (12) и 1,69 r (2,28 ммоль) пента- 40 вводят в хвостовую вену мьппей в диафторфенилового эфира три-бензилокси- пазоне доз от 25 до 50 мг/кг. Каждая карбонил-1-аргинина получают гекса- экспериментальная группа состояла пептнд (14) аналогично соединению (12). из 10 мышей. Анальгетический эффект
Очистка продукта, полученного после соединений оценивают по тесту "tail отгона растворителя, не проводится 45 pinch при помощи артериального зажнввиду плохой растворимости полученно- ма, который накладывают на основание го соединения. Выход 2,7 r (87 ) за- хвоста. Определение болевой реакции щищенного гексапептида (14). проводят через 5,15,30,60,90 мин
Тирозил-N -(аргинил-аспарагинил)-D- после введения и затем каждые 30 мин
8 орнитил-глицилфенилаланин (1). 50 до исчезновения болевой реакции.
К Ю,6 r (0,44 ммоль) защищенного гексапептида (14) в 20 мп метанола, . Результаты выражают альтернатив2 мл АсОН и 0,5 мп Н О добавляют пал- ным методом в проценте мышей, покаладиевую чернь и гидрируют в течение завших анальгетическую реакцию. При
2-3 ч. Катализатор отфильтровывают, 5::вычислении ЕД использован метод
se фильтрат упаривают. Остаток растира- Литчфилда и Уилкоксона. Анальгетичес- ют с эфиром и сушат в вакууме над гид" . кая активность и продолжительность роокисью калия. Полученный продукт действия соединений приведены в таб" растворяют в 5 мп 70 раствора TFA лице.
7 1182796 8
20
Аиальгетнческак активность аналогов энкефалнна
Внутривенное введение
Интрацистернальное введенине
Соединение рапевтискнй никс нри нутривенм введеОтно-. снтельная аналъгетнческая активность рфя"
ОтиосиПродолкительность анальге" тического эф" фекта прн
@1ао-ао н долелъ" ть тельная анальгетнческая активность морфин
-1002 нмаль жюъ моль
Ф"" кг ъгеескоэф" кта о-ao p
24 33 60 (25-90) 6 26 60
{l7-40) 0,006 йе действует
12;5
69 внутривенно
1 18 60 (l9-22) 100
Как видно из таблицы, описываемъ1й аналог знкефалина (1) является высокоактивным анальгетиком. Он в 24 раза активнее морфина и в 4 раза превосхо- дит по активности соединение — его близкий структурый аналог, хотя и уступает ему по продолжительности действия (30 и 90 соответствен но).
Недостаточная продолжительность действия описываемого соединения .ком пенсируется более высоким значением, терапевтического индекса, что характеризует описываемое соединение как высокоактивное и малотоксичное. мн туг№п"Gly-Phe 0,05 : .30
Arg"Авп - (0,03-0,10)
Tyr-bOzn-01у-Phe"йа0,2 90
Рго †«-1 (0,09-0,4)
Met-энкефалин 154 15 (90-2612
Морфин 12 60 (0,6 2,2) СРавнение ЕД б0 соединений (1) и
его аналога при внутривенном введении действительно показывает, что соединение (I) немного уступает аналогу, однако рассмотрение доверительных интервалов (25-50) и 17-40 мкмоль/кг указывает на то, что зти соединения при таком пути введения практически одинаково . активны и действуют до" статочно продолжительное время (продолжительность их действия равна продолжительности действия морфина).
Описываемое соединение (1) значительно менее токсично (ТИ ) 18 при внутривенном введении), чем его аналог (ТИ = 12,5 при внутривенном введении). По совокупности свойства описываемое соединение имеет преимущества перед известными ранее аналогами знкефалина.
1182796 и
Составитель
Техред Л.Олийнык
Корректор М,Максимишинец
Редактор С.Титова
Заказ 4358 Тираж 318 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул, Гагарина, 101
