Способ определения метотрексата

 

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к определению метотрексата (дезокси-4-амино N -метилфслиевая кислота), и может быть использовано для идентификации данного соединения в лекарственных средствах. Цель - повышение чувствительности и избирательности определения . Определение метотрексата ведут обработкой раствора анализируемого вещества химическими реагентами (ХР) с последующим измерением интенсивности флуоресценции полученного раствора . Обработку проводят ХР последовательно 25%-ным раствором гидроксида аммония, 5%-нь м раствором хлората ;калия и концентрированной НС1 при их объемном соотношении 1:1:(7-8):(0,8- 0,9). Способ в 10 раз более чувствителен и обладает более высокой избирательностью . 8 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (3!) 3 А1

f53)5 (01 N 21/64

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОбРЕТЕНИЯМ И ОТНЯТИЯМ

ПРИ П(НТ СССР . (21 ) 4037 228/28-04 (22) 14,03,86 (46) 23.03.90. Бюл. 9 и (71) Курский государственный медицинский институт (72) B.M.Иванов, A,А.Хабаров и О.А.Григорьев (53) 543.42.062(088,8) (56) Kllaithy M.M., El Tarras И,F., Tadros N.Â., Amer М.М. - Analytical

study of methotrexte, Analytical

Letters, 1982, В 15, N 11, 981-988.

Юденфренд С. Флуориметрический анализ в биологии и медицине, M.:

Химия, 1965, с. 394, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ METOTPEKCATA (57) Изобретение относится к аналитической химии, в частности к опредеИзобретение относится к области аналитической химии, а именно к способам определения метотрексата (дезокси-4-амино-М -метилфолиевая кислоfO та), и может быть использовано для идентификации данного соединения в лекарственных средствах с целью контроля их качества и количественного определения в воздухе производственных помещений при санитарном контроле и биологических жидкостях организма при фармакокинетических исследованиях, Целью изобретения является повышение чувствительности и избирательности определения, Способ осуществляют следующим образом, 2 лению метотрексата (дезокси-4-аминою

N -метилфолиевая кислота), и может быть использовано для идентификации данного соединения в лекарственных средствах. Цель — повьппение чувствительности и избирательности определения. Определение метотрексата ведут обработкой раствора анализируемого вещества химическими реагентами (ХР) с последующим измерением интенсивности флуоресценции полученного раствора. Обработку проводят ХР последовательно 257-ным раствором гидроксида аммония, 57-ным раствором хлората .,калия и концентрированной HCl при их объемном соотношении 1:1:(7-8):(0,80,9). Способ в 10 раз более чувствителен и обладает более высокой избирательностью, 8 табл.

К 1 мл раствора метотрексата в

0,1 н. растворе гидроокиси натрия прибавляют 1 мл 25%-ного раствора гидроокиси аммония, 7,2 мл 57-ного раствора хлората калия и 0,8 мл концентрированной соляной кислоты (35-.

38%-ной), Измеряют интенсивность флуоресценции полученного раствора относительно стандартного раствора с известным содержанием метотрексата. Зависимости интенсивности флуоресценции от количества 5%-ного раствора хлората калия и от количества концентрированной (35-387-ной) соляной кислоты приведены в табл.1 и 2 .соответственно.

Количества реактивов выбраны с учетом их максимальной растворимости

1438421 и длительности флуоресценции: 1 мл

257-ного раствора гидроокиси аммония, 7,2 мл 57-ного раствора хлората калия (cM.табл,1, это количество оптимально также с учетом количества всех остальных реактивов и для создания постоянного объема для проведения реакции . — 10 мл) и 0,8 мл концентрированной соляной кислоты (35- !О

38%-ной) (см.табл.2).. Использование

" запредельных количеств реактивов не позволяет достигнуть цели изобретения (см.табл.1 и 2), Данные о флуоресценции родственных 15 соединений приведены в табл.3, Данные по зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации метотрексата (калибровочный график) приведены в табл.4, Линейная зависимость между 10 концентрацией метотрексата и интенсивиостью флуоресценции наблюдается в пределах 0,001-8 мкг/мл.

Чувствительность определения со-, ставляет 0,001 мкг/мл метотрексата. 25

Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации метотрексата (калибровочный график) приведена в табл,4, Интенсивность флуоресценции сохраняется в течение 24 ч, 30

Пример 1, Качественное определение ме то тр ек с а та.

К крупинке порошка метотрексата или мелкоизмельченных таблеток прибавляют 1 мл 0,1 н, раствора гидро- 35 окиси натрия, встряхивают, прибавляют 1 мл 25%-ного раствора гидроокиси аммония, 7,2 мл 5%-ного раствора хлората калия. Перемешивают и добавляют 0,8 мл концентрированной соля- ц ной кислоты (35-387.-ной)„ Наблюдают ярко-голубую флуоресценцию при облучении раствора ультрафиолетовым светом с длиной волны 365 нм. Флуорес1 ценция указывает на содержание в 45 исследуемой пробе метотрексата.

Пример 2. Количественное определение метотрексата в крови (искусственная смесь).

К 1 мл крови, содержащей 1 мкг пре- 0 парата, прибавляют 4 мл 0,83%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и центрифугируют 1-2 с.

Затем в пробирку добавляют 30 мл насыщенного водой н-бутанола и после

10 мин смешивания центрифугируют

30 мин, 25 мл (аликвотная часть) органической фазы переносят в другую пробирку, добавляют 10 мл гексана и 0,02 мл

6 н. раствора гидроксида натрия, 2,5 мл дистиллированной воды перемешивают 5 мин и центрифугируют 3-4 мин, Органическая фаза удаляется. К водной фазе прибавляют 0,1 мл 507-ного раствора трихлоруксусной кислоты и 30 мл смеси гексанхлороформ в соотношении

2:1 и смешивают в течение 10 мин с последующим центрифугированием. Органическую фазу удаляют. К водной фазе прибавляют 30 мл смеси этилового эфира — хлороформа в соотношении 3:1, Смешивают в течение 10 мин и центрифугируют. Органическую фазу удаляют.

К 1 мл (аликвотная часть) водной фазы прибавляют 1 мл 257.-ного раствора r дpокcидa аммония, 7,2 мл 5%ного раствора хлората калия и 0,8 мл концентрированной соляной кислоты (35-38%-ной) ° Измеряют интенсивность флуоресценции исследуемого, стандартного и контрольного растворов на электрофлуориметре ЗФ-З,ИА, Концентрацию метотрексата в крови (Х) в мкг/мл вычисляют по формуле п1- по

X = — — - С 3,5, n - и о где n — интенсивность флуоресценции исследуемого раствора;

n — интенсивность флуоресценции стандартного раствора; и — интенсивность флуоресценции контрольного раствора

С вЂ” концентрация стандартного раствора метотрексата, мкг/мл;

3,5 — коэффициент разведения °

Приготовление стандартного раствора.

50 мг метотрексата (точная навеска) переносят в мерную колбу на 50мл, прибавляют 0,1 н, раствор гидроксида натрия, растворяют, доводят объем до метки. 1 мл полученного раствора переносят в мерную колбу на 2000 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой. Концентрация раствора

0,5 мкг/мл.

1 мл полученного раствора перено- сят в пробирку, добавляют 1 мл 25%ного раствора гидроксида аммония, 7,2 мл 57-ного раствора хлората калия и 0,8 мл концентрированной соляной кислоты (35-38%-ной), Концентра" ция раствора 0,05 мкг/мл, 1438421 п4 по — С 3,5

n - n о где и, по

Результаты определения приведены в табл,6.

Пример 3. Коли-.ественное определение метотрексата в моче 1искусственная смесь).

К 1 мл мочи, содержащей 10 мкг препарата, прибавляют 4 мл 0,83%-но-. го раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и центрифугируют 1-2 с.

Затем в эту пробирку добавляют 30 мл насыщенного водой н-бутанола и после

10 мин смешивания центрифугируют

30 мин.

25 мл (аликвотная часть) органической фазы переносят в другую пробирку и добавляют 10 мл гексана и

0,002 мл 6 н. раствора гидроксица натрия, 2,5 мл дистиллированной воды, перемешивают 5мин и центрифугируют.

3-4 мин. Органическая фаза удаляется. К водной фазе прибавляют 0,.1 мл

50%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и 30 мл смеси гексан — хлороформ в соотношении 2:1 и смешивают в течение 10 мин с последующим центрифугированием. Органическую фазу удаляют. К водной фазе прибавляют

30 мл смеси этилового эфира — хлороформа в соотношении 3:1. Смешивают в течение 10 мин и центрифугируют, Органическую фазу удаляют.

К 1 мл (аликвотная часть) водной фазы прибавляют 1 мл 25%-ного раствора гндроксида аммония, 7,2 мл 5%ного раствора хлората калия и 0,8 мл концентрированной соляной кислоты (35-38%-ной), Измеряют интенсивность флуоресценции исследуемого, стандартного и контрольного растворов на электрофлуориметре ЭФ"3 МА. Концентрацию метотрексата в биологической жидкости (Х) в мкг/мл вычисляют по формуле

- интенсивность флуоресценции исследуемого раствора;

- интенсивность флуоресценции контрольного раствора; — интенсивность флуоресценции стандартного раствора; — концентрация стандартного раствора метотрексата, мкг/мл; — коэффициент разведения, Для опрецеления используется стандGpTHblfl раствор с концентрацией 0,5 мкг/мл.

Результаты определения приведены в табл.7.

В табл.8 приведена зависимость интенсивности флуоресценции от соотношения используемых реактивов, ,9 Пример 4. Количественное определение метотрексата в воздухе рабочей зоны промышленных предприятий.

Исследуемый воздух со скоростью

15 2 л/мнн в течение 10 мин просасывают через два последовательно соединен" ных ноглотительных прибора Зайцева, содержащих по 5 мл 0,1 н, раствора гидроокиси натрия.

Содержимое поглотительных приборов объединяют, 1мл полученного раствора переносят в пробирку, добавляют 1 ип

25% †íî раствора гидроокиси аммония, 7,2 мл 5%-ного раствора хлората калия

25 и 0,8 мл концентрированной соляной кислоты (35-38%-ной). Измеряют интенсивность флуоресценции исследуемого, стандартного и контрольного растворов.

Концентрацию метотрексата, в воздухе рабочей зоны (Х) в мг/мл вьгчисляют по формуле

35 где А — количество метотрексата най» денное в анализируемом объеме 1 мл поглотительного раствора, мкг;

40  — объем поглотительного раствора, мл;

С вЂ” объем поглотительного раствора взятого для анализа, мл;

45 Y, — объем воздуха, отобранного для анализа приведенный к стандартным условиям, Количество метотрексата в анализируемом объеме 1 мл поглотительного раствора А в мкг вычисляют по форму.ле и<-п„

n — no где d — количество метотрексата в

55 стандартном растворе взяв том для проведения реакции

{ 1 мл), мкг;

n„ — показания флуориметра для исследуемого раствора, 1438421

Таблица 1

Количество хлора- Интенсивность флута калия, мл оресценции, %

1 28

2 38

3 44

4 52

5 62

6 68

7 70

8 70

9 68

10 66

Таблица 2

Количество соля- Интенсивность флуоной кислоты, мл ресценции, %, Таблица 3

Способ

Соединение известный предлагаемый

Фиолетовая флуо- Нет флуоресресценция ценции

Флуоресценции Флуоресценции нет нет

Фолиевая кислота

П-аминобензоилглутаминовая кислота

Глутаминовая кислота

Птеридин незамещеннь|й

Триамтерен

n — показания флуориметра для стандартного раствора;

n - показания флуориметра для контрольного раствора, При больших концентрациях метотрексата в воздухе исследуемый раствор подвергают разбавлению и расчет концентрации метотрексата Х вычисляют с учетом разведения, I0

По сравнению с известным, описываемый способ в 10 раз более чувствителен и, обладает более высокой избирательностью»

Формула изобретения

Способ определения метотрексата путем обработки раствора анализируемого вещества химическими реагентамн с последующим измерением интенсивности флуоресценции полученного раст- вора, о.т л и ч а ю шийся тем, что, с целью повьдпения чувствительности и избирательности определения, 25 обработку проводят последовательно

25%-ным раствором гидроксида аммония, 5%-ным раствором хлората калия и концентрированной соляной кислотой при объемном соотношении анализируе-. мой пробы, 25%-ного раствора гидроксида аммония, 5%-ного раствора хлората калия и концентрированной соляной кислоты 1:1:(7-8):(0,8-0,9) соответственно, 35

0,1

0,2

0 3

0,4

0,5

06

0,7

0,8

0,9

1 0

22

28

34

58

63

43842!

Таблица 4

Интенсивность флуоресценции, X

Концентрация метотрексата, мкг/мл

I 0,,1 0,01 0,001

2 0,2 0,02 0,002

3 0,3 0,03 0,003

4 0,4 0,04 0,004

5 0 5 0 05 0 005

6 0 6 0 06 0 006

0е7 Ое07 Ое007

8 0,8 0,08 . 0,008

9 Ор9 0 09 0,009

l0 1,0 0 ° 10 0)010

Таблица 5

Время, ч

Интенсивность флу" оресценции, %

Таблица 6

Содержание препарата в 1 мл, мкг

Определено, Метрологические мкг данные

Х = 0,92

S = O 018

S 0,007

0,018

«+0,018

А = « 1,8X

1p0

1,0

1,0

1,0

1,0

0,91

0,89

0 ° 92

0,94

0,93

1,0

0,93

Таблица7

Метрологические данные

Определено, мкг

Содержание препарата в l.мл, мкг

Х = 9i05

S = 0,187 Sх = 0,084

Е о,с> = 0 ° $05

Х +f095 9,05+0,205

А = 12,05

10,0

10,0

10,0

10,0

10,0

10,0

2

4

5.

24

48

8 ° 8

9ю!

9,0

9,2

8,9

9,3!

О

16

24

52

64

76

l6

22

56

64

78

18

26

38

48

54

66

72

24

38

44

54

62

68

72

82

1438421

Т а б л и ц а 8

Интенсивность флуоресценции, Ж, при содержании препарата в 1 мл раствора, мкг

0,001 0,01 0,1 0,1 8,0

Составитель Л,Русанова

Редактор М,Самерханова Техред М.Ходанич Корректор О,Кравцова, Заказ 997 Тираж 510 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.уигород, ул. Гагарина,301

Соотношения реактивов гидроксида аммония, хлората калия и серной кислоты

0,5:7,7:0 8

1,0:7,2:0,8

1,0:7,1:0,9

1,0з6,9з1,1

1 247 230 6

6

91

° 5 6 5

90 92 92

90 92 90

8 12 10

42 42 40