Способ определения состояния фитохрома в растительной клетке

 

Изобретение относится к способам определения содержания растительных пигментов и может быть применено в фотобиологии, физиологии растений и т.д. Цель изобретения - повышение чувствительности определения содержания и состояния нативного фитохрома. Образцы при комнатной температуре освещают дальним красным светом с длиной волн 720-740 нм, затем замораживают в сосуде Дьюара с жидким азотом до -196°С и измеряют спектры флуоресценции при ее монохроматическом возбуждении светом с длиной волны 580-660 нм и спектры возбуждения флуоресценции в области 580- ) 700 нм при регистрации флуоресценции в области 710-800 нм. Затем образцы размораживают до , освещают красным светом с длиной волны 660- 670 нм, после чего повторно замораживают и повторно измеряют спектры флуоресценции и ее возбуждения при соблюдении тех же условий. После этого образцы снова размораживают до 0°С, освещают дальним красным светом с длиной волны 720-740 нм, замораживают и повторно измеряют спектры флуоресценции и ее возбуждения. О состоянии и количестве фитохрома в клетке судят по исходным и разностным спектрам флуоресценции и ее возбуждения . 1 ил. о в (Л с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ц 4 А 01 G 7/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ н мвто ском свидятельствм

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4163594/31-13 (22) 19.04,86 (46) 15.01.89. Бюл. N 2 (71) ИГУ им. N.B. Ломоносова (72) В.А. Синещеков и А.В. Синещеков (53) 581.174(088.8) (56) Butler W.L., Norris K.Н., Siegelman НЛ., Hendricks S.B °

Detection, assay and preliminary

purification of the pigment controling photoresponsive development of

plants. Proc. Nate. Acad ° Sci. USA, !959, V..45, р. 1703. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯ

ФИТОХРОИА В РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКЕ (57) Изобретение относится к способам определения содержания растительных пигментов и может быть применено в фотобиологии, физиологии растений и т.д. Цель изобретения — повышение чувствительности определения содержания и состояния нативного фитохрома. Образцы при комнатной температуре освещают дальним красным све„„80„„145О788 А1 том с длиной волн 720-740 нм, затем замораживают в сосуде Дьюара с жидким азотом до -196 С и измеряют спектры флуоресценции при ее монохроматическом возбуждении светом с длиной волны 580-660 нм и спектры возбуждения флуоресценции в области 580700 нм при регистрации флуоресценции в области 710-800 нм. Затем образцы размораживают до 0 С, освещают красным светом с длиной волны 660670 нм, после чего повторно замораживают и повторно измеряют спектры флуоресценции и ее возбуждения при соблюдении тех же условий. После этого образцы снова размораживают с о

Ж до 0 С, освещают дальним красным светом с длиной волны 720-740 нм, замораживают и повторно измеряют спектры флуоресценции и ее возбуждения.

О состоянии и количестве фитохрома в клетке судят по исходным и разностным спектрам флуоресценции и ее возбуждения. 1 ил. Ф®

1450788

Изобретение относится к способам определения содержания растительных пигментов и может быть применено в фотобиологии, физиологии растений, биохимии, биофизике, ботанике, растениеводстве, марикультуре, биотехнологии.

Цель изобретения — повьппение чувствительности определения содержания и состояния нативного фитохрома.

На чертеже представлены графики спектров низкотемпературной (-196 С) флуоресценции фитохрома в клетках стеблей этиолированных проростков 15 гороха (Pisum sativum) после предварительного освещения их дальним красным светом (720-740 нм) (спектры 1, 1 ) красным светом (660-670 нм) (спектры;

2,2 ) и снова дальним красным светом 20 (спектры 3,3 ),-спектры излучения флуоресценции (1 -3 ), спектры возбуждения флуоресценции (1-3) и соответствующие разностные спектры: спектр

4 = спектр 1 минус спектр 2 и спектр 4 = спектр 1 минус спектр 2.

Образцы при комнатной температуре освещают дальним красным светом с длиной волны 720-740 нм, после чего их замораживают в сосуде Дьюара с жидким азотом до -196 С (или в криостате до температуры, близкой к температуре жидкого азота; -190 С) и измеряют спектры флуоресценции при ее монохроматическом возбуждении светом с длиной волны 580-660 нм и спектры возбуждения флуоресценции в области

580-700 нм при регистрации флуоресценции в области 710-800 нм. Затем образцы размораживают до 0 С, осве- 40 щают красным светом с длиной волны

660-670 нм, после чего повторно замораживают и повторно измеряют спектры флуоресценции и ее возбуждения при соблюдении указанных условий. 45

После этого образцы снова размораживают до 0 С, освещают дальним красным светом с длиной волны 720-740 нм, замораживают и повторно измеряют спекTpbl флуоресценции и ее возбуждения. 50

Доказательством того, что.зарегистрированная при измерении указанных спектров флуоресценция принадлежит фитохрому (его красной форме), является практически полная обратимость изменений флуоресценции, вы-, званных красным светом, при последующем освещении образцов дальним красным светом, глубина изменений (около

80Х), а также близкое сходство полученных спектров фитохрома в клетке имеющихся в литературе спектров выделенного очищенного фитохрома. Об общем количестве, состоянии и нативных свойствах фитохрома в клетке судят по исходным и разностным спектрам флуоресценции и ее возбуждения.

Интенсивность в максимумах флуоресценции (686 нм) и возбуждения флуоресценции (673 нм) является по сазателем, отражающим содержание всего фитохрома в клетке, интенсивность в соответствующих максимумах в. разностных спектрах пропорциональна содержанию фотоактивного при физиологических температурах пигмента. О нативных характеристиках фитохрома и их изменениях судят по форме и положению полос в спектрах возбуждения флуоресценции (спектры 1-3) и в спектрах излучения флуоресценции (1 -3 ), Для иллюстрации этого приведен спектр излучения флуоресценции лиофилизованных этиолированных проростков гороха (спектр 5 ). Видно, что высушивание приводит к сдвигу спектра на 2-3 нм в длинноволновую сторону по сравнению с исходным спектром (спектр 1 ).

Пример 1. Берут участки стеблей 5-дневных этиолированных проростков гороха (Pisum sativum) имеющие низкое по сравнению с -листьями содержание протохлорофилла. Помещают их в пластмассовую кювету (толщина кюветы 0,5 см) и освещают в течение 30 с дальним красным светом с длиной волны 720 нм от осветителя типа "Свитязь" в комбинации с интерференционным светофильтром (полуширина спектрального интервала 7 нм, интенсивность света 10-100 Вт(м ), после чего кювету с образцом опускают в сосуд Дьюара с жидким азотом, установленный в спектрофлуориметре, и регистрируют спектр флуоресценции фитохрома в области 640-750 нм при спектральной ширине щелей 2 нм и возбуждении флуоресценции светом с длиной волны 580 нм (полуширина спектрального интервала возбужцающего света 2 нм) . Затем регистрируют спектр возбуждения флуоресценции в области

580-700 нм (спектральная ширина щели

2 нм) при интегральной регистрации излучения в диапазоне 710-800 нм, который определяется областью пропуска1450788 ния комбинации граничных светофильтров КС-17 и ФС-6 и границей чувствительности фотоприемника ФЭУ-?9 (око— ло 800 нм) . После этого кювету с образцом вынимают из сосуда Дьюара, об-

1 с, разец размораживают до 0 С, освещают в течение 30 с красным светом с длиной волны 660 нм, замораживают, погружая в сосуд Дьюара, и регистриру- 10 ют спектры флуоресценции и ее возбуждения при аналогичных условиях. Затем размораживают образец до 0 С, освещают дальним красным светом с.длиной волны 720 нм, эамораживают до -196 15 и измеряют спектры. Состояние фитохрома в тканях этиолированных проростков гороха характеризуют следующие полученные параметры: положение максимума в спектрах возбуждения флуорес-2О ценции (и, соответственно, спектре поглощения) 673 нм и в спектре флуоресценции 686 нм, а также форма спектров.

Концентрацию фитохрома в клет- 25 ках проростков, равную 1,3 10 г/л, определяют по интенсивности флуоресценции пигмента в максимумах спектров ее излучения 686 нм и возбуждения 673 нм. Необходимую для такого З0 определения калибровку спектрофлуориметра проводят, используя в качестве стандарта образец, например колеоптили ячменя, концентрацию фитохрома в которых устанавливают спектрофотометрически. Глубина превращения фитохрома в образце под действием света составляет 827. Это говорит о том, что практически весь присутствующий В тканях IIpopocTKQB пиг 40 мент находится в фотоактивном состоянии и что полученные данные характеризуют красную фотоактивную форму фитохрома.

Пример 2. Берут участки стеблей этиолированных проростков гороха и проводят с ними операции аналогично примеру 1. При этом дли- . ну волны действующего дальнего красного света и красного света устанавливают соответственно 740 нм и 670 нм, длину волны возбуждающего монохроматического света при измерении спектров флуоресценции — 660 нм, коротковолновую границу регистрируемого излучения при измерении спектров возбуждения флуоресценции — 720 нм. Остальные условия аналогичны примеру 1.

11олучаемые спектральные характеристики фитохрома аналогичны таковым в примере 1. Количество фитохрома определено в 1,4 10 г/л. Глубина превращения красной формы фитохрома в этих условиях несколько ниже и составляет 80%.

Пример 3. Берут этиолированные проростки гороха и проводят с ними все операции аналогично примеру

1. Световыми условиями проведения эксперимента являются следующие: длина волны действующего дальнего красного света 700 нм, длина волны действующего красного света 640 нм, длина волны возбуждающего света при регистрации спектров излучения 550 нм, коротковолновая граница диапазона регистрируемого излучения при измерении спектров возбуждения флуоресценции 6SO нм (светофильтр КС-18) .

При таких условиях не удается провести определение фитохрома по следующим причинам: глубина фотопревращения фитохрома под действием указанных длин волн невелика спектр флуоресценции сильно искажен вследствие влияния фоновой флуоресценции и низкой собственной флуоресценции фитохрома спектры возбуждения флуоресцепции не удается зарегистрировать вследствие влияния рассеянного возбуждающего света в области главного максимума.

Пример 4. Берут этиолированные проростки и проводят с ними все операции аналогично примеру 1, Световыми условиями проведения эксперимента являются следующие: длина волны действующего дальнего красного света 700 нм, действующего красного света 700 нм, длина волны возбуждающего света при регистрации спектров флуо- ресценции 680 нм, длина волны коротковолновой границы регистрируемого интервала флуоресценции 730 нм. При указанных условиях невозможно провести определение фитохрома в клетке.

Использование предлагаемого способа позволяет повысить чувствительность определения содержания и состояния нативного фитохрома в клетке.

Формула изобретения

Способ определения состояния фитохрома в растительной клетке, включающий исследование. спектральных ха1450788

600 880 ЖО 860 6ВО 7М МО Жд Мкм

Составитель Е .Гкрадюк

Редактор С.Лисина Техред Л.Олийнык Корректор Л.Чатай

Заказ 7003/2 Тираж 618 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 рактеристик растительной ткани выращенных в темноте проростков, путем освещения растительных тканей красHbM светом. Измерения спектров повтор- 5 ного освещения дальним красным светом, повторного измерения спектров и вынесения суждения о состоянии фитохрома по спектральным характеристикам, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и возможности количественного определения содержания фитохрома в растительной клетке, в качестве спектральной характеристики ис- 16 следуют спектры флуоресценции, при этом перед измерением спектров растительную ткань предварительно освещают дальним красным светом, затем

I замораживают до температуры (-190)(-196) С, измеряют спектры флуоресценции при возбуждении флуоресценции в области 580-660 нм и спектры возбуждения флуоресценции в области 580700 нм при регистрации в области

710-800 нм, затем образцы размораживают до 0 С, освещают красным светом перед измерением,спектров, повторно эаморажнвают, измеряют спектры флуоресценции при тех же условиях, перед освещением дальним красным светом размораживают, а перед повторным измерением спектров растительную ткань опять замораживают, а о состоянии и количестве фитохрома в клетке судят по исходным и разностным спектрам флуоресценцни и ее возбуждения.