Способ определения оптимального состава среды для культивирования подвижных микроводорослей

 

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности и может быть использовано при выборе сред для культивирования подвижных микр оводорослей и бактерий. Целью изобретения является повышение точности, упрощение и снижение трудоемкости оценки степени оптимальности сред по токсической реакции микроорганизмов . Способ заключается в создании контакта между исходной суспензией клеток и испытываемыми средами на микроповерхности в системе из соединенных между собой в нижней части стеклянных сосудов и учете количества переместившихся в разные среды клеток после нескольких часов экспо-; зиции. 3 табл. с W

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (И) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4231060/30-13 (22) 17.04.87 (46) 15.01.89. Бюл. М 2 (71) Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева (72) К.С.Спекторов и А.А.Захарин (53) 636.085:639.64 (088.8) (56) Microbiol., J.Gen. Vol. 74, Р 81, 1973, 77-91, Physiologia Plantarum, Vol. 22, P 1, 1969, 126-139.

Microbiology. J. Gen, Vol. 102, Н 1, 1977, 199-202. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОПТИМАЛЬНОГО

СОСТАВА СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ПОДВИЖНЫХ ИИКРОВОДОРОСЛЕЙ е и 4 С 12 К 1/12 А 01 (33/00 (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано при выборе сред для культивирования подвижных микроводорослей и бактерий. Целью изобретения является повьппение точности, упрощение и снижение трудоемкости оценки степени оптимальности сред по токсической реакции микроорганизмов. Способ заключается в создании контакта между исходной суспензией клеток и испытываемыми средами на микроповерхности в системе из соединенных между собой в нижней части стеклянных сосудов и учете количества переместившихся в разные среды а ф клеток после нескольких часов экспо-; зиции. 3 табл.

1451162

Изобретение относится к микробиологической промьппленности и может быть использовано при выборе сред для культивирования подвижных микро5 водорослей.

Цель изобретения — повьппение точности и упрощение способа оценки степени оптимальности состава сред по токсической реакции подвижных микроводорослей.

Способ позволяет осуществлять прямой подсчет числа клеток и определить вес их сухой биомассы в единице объема исследуемой среды и контролировать физико-химический состав этой среды не только по окончании опыта, но и в динамике, т.е. неоднократно по ходу эксперимента. Способ возможно осуществить двумя вариантами 20

При первом варианте осуществления способа подвижные микроводоросли выращивают до достаточной плотности (10-20 10 кл/мл) на исходной среде в культуральной камере емкостью 25

500 мл, продуваемой снизу смесью воздуха с СО . После этого в суспензию водорослей через отверстие в крышке камеры вставляются стеклянные трубки типа пипеток с оттянутым кончиком (площадь отверстия кончика

0,15-0,90 мм, емкость трубки 23 мл), целиком заполненные исследуемой средой и загерметизированные сверху короткой стеклянной палочкой, вставленной в отрезок резиновой трубки, надетой сверху на пипетку. Среды в трубках и в культуральной камере при этом практически не смешиваются, если только удельный вес сред в труб- 40 ках не превьппает значительно удельного веса среды и культуральной камере. Подвижные микроводоросли из камеры переходят a,òðóáêè с исследуемыми средами в количествах, пропор" циональных степени оптимальности данной среды для их жизнедеятельности. Через 1-2 сут стеклянные трубки вынимают из камеры с культурой и сбдержимое их анализируют обычными методами (плотность суспензия по числу клеток определяют подсчетом в камере Горяева, общая концентрация солей в среде высушиванием 1 мл и взвешиванием сухого остатка, содержание отдельных элементов в среде методом плазменной фотометрии и т.п.).

При втором варианте осуществления способа подвижные микроводоросли выращивают в любом культуральном сосуде до той же примерно плотности„ что и при первом варианте осуществления способа.

После этого 50 мл суспензии микроводорослей заливают в одно из колен закрепленной на штативе U-образной системы, состоящее из двух загнутых снизу под прямым углом трубок диаметром 20 мл, соединенных в нижней своей суженной части прозрачной эластичной трубкой пережатой посередине зажимом. Во второе колено системы заливают исследуемую среду любого состава и любого удельного. веса.

Остатки вс здуха из горизонтального участка системы удаляют пальпированием эластичной трубки. После этого зажим в горизонтальной части системы осторожно удаляют и обе среды соединяются одна с другой таким образом, что между ними образуется поверхность раздела фаз достаточно большой площади (10-12 мм ). Систему можно усложнить, составив ее из трех (Ш-образная система) и более сообщающихся сосудов (через стеклянные тройники в нижней части). Через поверхность. раздела фаз микроводоросли из исходной среды свободно переходят в . колена с исследуемыми средствами в соответствии со степенью оптимальности каждой исследуемой среды для их жизнедеятельности. В вертикальные части трубок системы можно вставлять сверху тонкие стеклянные капилляры или пластиковые трубочки, через которые культура продувается смесью воздуха с СО . Через определенные промежутки времени (обычно раз в сутки) из трубок отбирают пробы для определения плотности культуры по числу клеток и по весу сухой биомассы клеток в единице объема суспензии и для одновременного контроля за тем, насколько сохраняется постоянство каждой из сред в трубках по ее физико-химическим показателям.

Пример 1. Штамм подвижных микроводорослей Dunaliella primolecta Butch. й" 63, полученный из коллекции Института Ботаники AH УССР„ выращивают в культуральной камере емкостью 500 мл, продуваемой снизу смесью воздуха с 0,5Х СО до плотности

20- 10 кл/мл на среде следующего состава, г/л: NaCl 29,0; KNO> 5,0;

КНаР04 0,5; KtHP04 3HzO 0,75; NgC1„ 6

1162

Продолжение табл.3

Характер иссле

5 дуемой среды .: ержание иоов, г/л гОсновная среда, разбавленная в

8 раз

1,398 0,698

Таблиц.а 2

Т аблица 1

Вариант среды

Число клеток,10 кл/мл

Содержание ионов, г/л

Характер исследуемой среды

Иа К

0,030

Основная среда без

NaC1, разбавленная в 4 раза

0,047 0,822.среда, раэбав8 раз

Основная ленная в

Основная среда без

NaC1, разбавленная в 1,5 раза

1, 156

0,062 1,701

Таблица 3

Вариант среды Содержание ионов, г/л

ОсмотичесЗначение рН кое

Na давление,атм

Основная среда без

NaC1, разбавленная в 4 раза

0,048 0,827

2,08

7,72

Основная среда без

NaC1, разбавленная в 1,5 раза

3,26

0,048 1,665

7,75

Основная среда, разбавленная н 8 раз 1,366 0,694

3,88

7,75 з 145

0,38; MgSO< 7Н О 0,24; раствор микроэлементов А 1 мл, раствор FeSO@

7 Н О в смеси с ЭДТА (FeS04 7Н О

3 мг/л и ЭДТА 37 мг/л) 1 мл. Содержание Na в этой срере равно 11,41 г/л, К ) 2,33 г/л, так как значение рН среды ро 7 0 доводили при помощи КОН.

После этого в суспензию водорос= лей через отверстия в крышке камеры вставляют стеклянные трубки типа пипеток с оттянутым кончиком, заполненные исследуемыми средствами и загерметизированные сверху короткой стеклянной палочкой, вставленной в надетый на пипетку отрезок резиновой трубки.

В табл.1 показан характер иссле цуемых сред и содержание в них основi ных ионов °

При этом исходные параметры исследуемых сред в трубках, как это

В табл.2 приведено среднее число клеток, обнаруженных через 2 сут. в трубках-пипетках с исследуемыми средами.

Основная среда без NaCl разбавленная в 4 раза

Основная среда без NaC1, разбавленная в 1,5 раза 0,175

1 видно иэ табл.3, сохраняются практически без изменений.

14511

5

Таким образом, отсутствие NaC1 в среде является фактором, неблагоприятным для жизнедеятельности Dunalie11a primolecta. В случае от5 сутствия NaC1 в среде водоросли отдают предпочтение менее разбавленной по сравнению с исходной срере, т.е. предпочитают среру с более высоким осмотическим давлением. 10

Пример 2. Штамм водорослей

Dunaliel1a salina Теор. Р 10, полученный из коллекции культур института Ботаники АН УССР, выращивают на среде того же состава, что и Dunalie- 15

1la primolecta Butch. штамм 63, но содержащей NaC1 в количестве не

29,0, а 87,0 г/л. В остальном водоросли выращивают в тех же условиях, что и Dunaliella primolecta до плотности 10.10 кл/мл.

Монтируют на штативе Ш-образную систему, состоящую из трех вертикально расположенных трубок, соединенных снизу через стеклянный тройник 25 прозрачным шлангом из силиконовой резины, пережатым между трубками при помощи съемных зажимов, затем в среднюю трубку заливают 50 мл полученной суспензии водорослей, в левую трубку 30 такое же количество чистой осходной среды разбавленной в 2 раза, а в правую — ту же среду, но разбавленную в 4 раза (также 50:мл). После этого, не снимая зажимов пальпированием шлангов, удаляют оставшиеся в системе пузырьки воздуха, а затем осторожно снимают зажимы. Между исходной суспензией водорослей и исследуемыми средами в результате этого об- 40 разуются поверхности непосредственного соприкосновения (раздела фаз), обеспечивающие микроводорослям возможности свободно перемещаться из средней трубки в боковые, Установлено, что через 48 ч культивирования микровороросли из средней трубки переместились в левую трубку, тогда как срера в правой трубке осталась совершенно прозрачной.

Таким образом, исходная культуральная среда, разбавленная в 4 раза, становится неблагоприятной для жизнедеятельности Duneliella salina и они из плотной Исходной суспенэии в поисках более благоприятных по освещенности условий перемещаются только в среду, содержащуюся в левой трубке, т.е. их осмотаксис положителен только по отношению к исходной среде, разбавленной не более чем в 2 раза.

Формула изобретения

Способ определения оптимального состава среды для культивирования подвижных микроворорослей, включающий выращивание микроводорослей в сосуде с контрольной средой с последующим контактированием полученной культуры водорослей с исследуемой средой и определением токсической реакции микроводорослей по отношению к исследуемой среде, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа, контактирование культуры водорослей с исследуемой средой осуществляют путем создания поверхности раздела фаз с исследуемой средой, находящейся по крайней мере в одном сообщающемся сосуде с сосудом с контрольной средой, с последующей инкубацией культуры водорослей.

Составитель Е.Золотухина

Техред А.Кравчук Корректор И.Эрдейи

Редактор N.Íåäîëóæåíêo

Заказ 7036/20

Подписное

Тираж 500

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5