Способ определения молекулярно-массовой неоднородности микробных полисахаридов

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается исследования состава микроб1шх экзополисахаридов. Целью изобретения является расширение технологических возможностей способа за счет увеличения диапазона исследуемых .молекулярных масс. Способ заключается в том, что фракционирастворов экзополисахаридов и стандартов молекулярных масс происходит в комбинированном градиенте солей NaCl и CsCl, взятых в соотношении 5:1-1:1, и плотности NaCl р 1,03-1,20 г/см CsCl р 1,2- 1,6 г/см при п 30000 об/мин в течение 19 ч. 8 ил., 2 табл. а

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

36 А1 (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

fl0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4129904/31-!3 (22) 16.09.86 (46) 15.01.89. Бюл. Р 2 (71) Институт микробиологии и вирусологии им. акад. Д.К.Заболотного (72) С.К.Воцелко, Т.П,Пирог, IO.P.Ìàëàøåíêo, Т.А.Гринберг (53) 663.15 (088.8) (56) Holzwarth G. Molecular weight

of xanthan polysaccharide. СагЪ.

Researoh, 66, 1978, 173-186. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО"

МАССОВОЙ НЕОДНОРОДНОСТИ МИКРОБНЫХ

ПОЛИСАХАРИДОВ (51)4 С 12 Р 19/00 G 01 N 11/10 (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается исследования состава микробных экзополисахаридов.

Целью изобретения является расширение технологических возмозностей способа за счет увеличения диапазона исследуемых .молекулярных масс. Способ заключается в том, что фракционирование растворов экзополисахаридов и стандартов молекулярных масс происходит в комбинированном градиенте солей NaC1 и СзС1, взятых в соотношении 5:1-1:1, и плотности NaCl

1,03-1,20 г/см, CsC1 р 1,21,6 г/см при п = 30000 об/мнн в течение 19 ч. 8 ил., 2 табл.

145!166

Изобретение относится к биотехнологии и касается исследования состава экзополисахаридов (ЭПС), образуемых различными видами микроорганизмов при культивировании их на угле5 родных субстратах.

Цель изобретения — расширение технологических воэможностей способа за счет увеличения диапазона исследуемых молекулярных масс.

Изобретение заключается в том, что для разделения полисахаридов (ЭПС) и растворов декстранов, применяемых в качестве стандартов молекулярных масс, используют комбинированный градиент солей NaC1 и CsC1, взятых в соотношении 5: l — 1: 1 при постоянном суммарном объеме, плотности растворов NaCl f = 1,03-1,30 г/см(20

3 (sC1. = 1,20-1,60 г/см при п =

= .30000 об/мин в течение 19 ч.

Исследование растворов нативных микробных ЭПС исключает необходимость предварительного разделения ЭПС на фракции и их раздельное градиентное центрифугирование. Применение стандартов молекулярных масс (декстранов) значительно упрощает определение молекулярных масс, не требует расчетов гидродинамических параметров. Использование комбинированного градиента NaC1 и СзС1 позволяет определить молекулярную массу в диапазоне

13 7 тыс.. — 2 млн. Кроме того меj 4

35 тод дает возможность одновременного анализа нескольких микробных ЭПС (до 6-8 проб одновременно), Исследования молекулярно-массовой неоднородности ЭПС, проведены на синтезированных культурой Xanthomonas campestris шт, 8162 (a, 5), смешанной культурой дрожжей и бактерий на основе этанола (в, z) ксантана фирмы "Sigma";(у), где: О- ЭПС, полУченный на Ладыженском заводе ферментных препаратов; 6- ЭПС, полученный: в лабораторных условиях; в, т- ЭПС, синтезированные при различных условиях культивирования.

Стандарты углеводной природы—

50 декстр аны (фирмы "РЬагшасха","Гегас", "Г1Ыса") различных молекулярных масс, используется при определении молекулярно-массовой неоднородности ЭПС, молекулярной массы отдельных компонентов ЭПС методами гель-хроматографии.,ппя упрощения анализа согласно способу также предлагается применение декстранов в качестве стандартов мол(кулярных масс. Применяют декстраны фирмы "Fluka".мол.массой 13,7 тыс., 20 тыс., 110 тыс., 500 тыс., 2 млн.

В соответствии с изобретением проведена проверка молекулярных масс декстранов фирмы "Fluka" методом аналитического ультрацентрифугирования (метод скорости седиментации). Молекулярную массу рассчитывают по уравнению Сведберга. Рассчитанные значения молекулярных масс декстранов не отличаются от значений, указанных фирмой-изготовителем.

Б присутствии NaC1 и СsC1 свойства декстранов не меняются (не наб" людается ни деградация.их, ни структурирование).

Используют в работе 0,05Х-ные растворы ЭПС и 0,02%-ные растворы декстранов. Центрифугирование осу ществляют на центрифугах К-32, К-32М, "Beckman" в пробирках объемом 9,5 мп и 13,5 мп. Полученные результаты представляют на эмпирических кривых .молекулярно-массового распределения, где по оси ординат отложена интенсивность поглощения при

Л = 490 нм (реакция с фенолом и серной кислотой), а по оси абсциссномера фракций объемом 0,25-0,50 мп в зависимости от объема центрифужных пробирок (фиг,1).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Показывают стабильность реологических свойств и гидродинамических параметров исследуемых

ЭПС в присутствии различных концентраций NaC1 и CsC1.

В табл.1 приведены данные по изменению вязкости О, 17-ных растворов

ЭПС 5 в и ксантана "Sigma в зависимости от различных концентраций

НаС1 и CsC1.

Таблиц а1

КсанКонцентрация солей тан

6 87 6е44 7в72

NaC1

0,0()5 N 6,85 6,40 7,65

0,010 M 6,81 6„40 7,70

1451166

Следовательно, в присутствии СеС1 и . NaC1 вязкость растворов исследуемых ЭПС, а также их гидродинамические параметры остаются неизменными, что свидетельствует о стабильности структуры ЭПС в условиях градиента. Следует отметить, что способ применяют для анализа микробных ЭПС, проявляющих свойства, аналогичные исследуемым ЭПС (т. е. стабильность структуры в присутствии ЯаС1 и Cs Cl) .

Продолжение табл.1

Концентрация, соответствующая ппот иост и

1,2 г/см 6,88

6,43 7,75

CsC1

0,005 M 6,83

0,010 М 6,85

6,46 7,70

6,39 7,70

Конц ентр ация, соответствующая плотности 1,6 г/см 6,87

6,47 7,70

Таким обр аз ом, в при су т ст вии солей NaCl и CsC1 вязкость исследуемых

ЭПС не изменяется, т,е. не наблюдается ни деградация, ни структурирование ЭПС.

В табл.2 приведены гидродинами30 ческие параметры ЭПС о ° 1идродинамические свойства изучали в водных растворах на аналитической центрифуге МОМ-3170 6 методом скорости седиментации. Седиментацию проводили в З5 обычной ячейке при 48000 об/мин, диффузию — в ячейке с искусственной границей при 4000-8000 об/мин.

Таблиц а2

S ?О

W 10

Д 20

W 10 см.Растворы ЭП б

0,70

5,50

Вода

0,005 М

NaC1

0,005 М

Св Cl

5,45

0,70

0,65

5,50

Примеч ани e. S 20W — конст ант а седиментации, Д 20 W —константа диффузии.

Пример 2. Иллюстрируют флуоресцентной метки при определении молекулярно-массовой неоднородности нативного ЭПС 8 в комбинированном . градиенте NaC1 и CsC1 (вместо качественной реакции с фенолом и серной кислотой).

Перед градиентным центрифугированием проводят обработку ЭПС ь органическим красителем "ФИТЦ" ("Яегча") °

Проводят обработку нативного ЭПС, не разделенного на фракции. Осуществ". ляют центрифугирование меченого и необработанного (контрольного) ЭПС в комбинированном градиенте NaC1 и

CsC1 взятых в соотношении l:1 при

n = 30000 об/мин в течение 19 ч.

Уровень свечения фракций "меченого"

ЭПС измеряют на приборе JI10MAM-И2,. содержание углеводов во фракциях контрольного ЭПС определяют по реакции с фенолом и серной кислотой. На фиг.1 представлено молекулярно-массовое распределение ЭПС Ь в комбинированном градиенте NaC1 и CsC1(1 -меченый ЭПС, 2 — контрольный ЭПС).

Таким образом, применение реакции с фенолом и серной кислотой для анализа содержания углеводов во фракциях не ведет к снижению качества анализа по сравнению с использованием флуоресцентной метки.

Пример 3. Показывают молекулярно-массовое распределение ЭПС и декстранов в комбинированном градиенте NaC1 и СэС1, взятых в pasличных соотношениях при п — 30000 об/мин в течение -19 ч (плотность растворов NaC1, 1 = 1,03—

1,20 г/см, CsC1, р = 1,20-1,60 г/см }

На фиг.2-4 показано молекулярно-массовое распределение ЭПС а,6, Ь, .и декстранов в комбинированном градиенте плотности NaC1 и CsC1 взятых в соотношении 1:1 (фиг.2), 2:1 (фиг.3), 5:1 (фиг.4).

5 14

На фиг.5 показано молекулярно-массоное распределение ЭПС, синтезируемого Xanthomonas campes tris шт. 8162 в комбинированном градиенте плотности солей NaC1 и CsC1 при их соотношении 2:1 (А,1), 5!1 (А,2), 1,4:1 (А,З;Б).

Как видно из фиг.2-4, изменяя соотношение солей NaC1 и CsC1 в зависимости от поставленной экспериментаторои задачи, можно более де" тально исследовать те или иные компоненты ЭПС различной молекулярной массы. Так, увеличение объема растворов NaC1 (соотношение NaC1 и CsC1

5:1) даст возможность четкого разделения низкомолекулярных составляющих (до 500 тыс.) (фиг,4), в то время как увеличение объемов растворов

СзС1 (соотношение ИаС1 и CsC1 2:1, 1:1), обладающих более нысокой плотностью, позволяет успешно разделить высокомолекулярные фракции от 500 тыс. до 2 млн. (фиг,2 и 3). Аналогичные выводы можно сделать исходя из кривых молекулярно-массового распределения, представленных на фиг.5.

Пример 4, Показывают возможности использования предлагаемого метода для анализа ЭПС, синтезируе-. мых культурами-продуцентами ЭПС в различных условиях культивирования с целью выбора оптимального режима для получения ЭПС с заданными свойствами (фиг.3 фиг.5, пример 3) .

П р и м, е р 5. Показывают целесообразность применения комбинированного градиента плотности: солей ЖаС1 и СзС1 для анализа ЭПС.

На фиг.6 показано молекулярно-массове распределение ЭПС, синтезируемого смешанной культурой дрожжей и бактерий в градиенте плотности NaC1 (А) (n = 30000 об/мин, 4 ч (2), 19 ч (1) и в комбинированном градиенте плотности солей NaC1 и СзС1 (Б) (n = 30000 об/мнн, 19 ч) при соотношении NaC1 и GsC1 2:1 (3) и

1:1 (4).

Применение растворов NaC1 более высоких плотностей (р = 1,03-1,20 г/см, р = 1,03-1,05 г/cM ) позноляет получить молекулярно-массовое распределение компонентов с мол. массой 20 тыс. — 500 тыс., т.е. в этом случае удается расширить нижнюю границу определяемых молекулярных масс от 180000 до 20 тыс.

51166 6

Время центрифугиронания, равное

4 ч, является недостаточным для разделения компонентов ЭПС по сравнению с центрифугированием в течение 19 ч

Б (фиг.6A) . Для разделения компонентов

ЭПС с мол.массой более 500 тыс. использовали растворы CsC1 плотностью p = 1,20-1,60 г/см (фиг.6В).

Пример 6. Показывают возможность одновременного расширения нижнего и верхнего пределов диапазона определяемых молекулярных масс при использовании комбинированного гради ент а NaC1 и С зС1.

Как указывалось,,в примере 5, применение градиентов с плотностью у =

1,03-1,20 г/смЭ позволяет расширить нижнюю границу определяемых мо2п,пекулярных масс до 20 тыс., введение

СяС1 плотностью p = 1,20-1,60 г/см ,в градиент дает возможность анализа высокомолекулярных компонентов (500 тыс., — 2 мпн).

25 В данном примере в качестве стандарта молекулярных масс, кроме применяемых ранее, используют декстран с молекулярной массой 13,7 тыс, На рис.ба предстанлено молекулярSp но-массовое распределение ЭПС B npu центрифугировании в комбинированном градиенте NaC1 (р = 1,03-1,20 г/см,)

Э и CsC1 (р = 1,20-1,60 г/смэ), взя- тых в соотношении 5:1, в течение

19 ч при n = 30000 об/мин.

Применение комбинированного гради-. ента NaC1 и CsC1 для ЭПС позволяет расширить как нижний предел определяемых молекулярных масс (менее

20 тыс, по сравнению с применением градиента растворов хлористого натрия), так и верхнюю границу диапазона молекулярных масс (500 тыс, 2 мпн) .

При этом результаты, представленные на фиг.ба, согласуются с полученными ранее (см,пример 3, фиг.4в).

Наличие пика в первой фракции ЭПС В (фиг. 4) соответ ствует фракции с мол.массой I3,.7 тыс.., .как показано в данном примере.

Пример 7. Показывают соответcraze результатов, полученных при применении предлагаемого метода для

55 анализа микробных ЭПС и гель-хроматографии. На фиг.7 представлен элюционный профиль ксантаиа "Sigma" при гель-хроматографии на колонке с сефарозой 4В (размеры колонки 0,9

7 145 х80 см). Элюент 0,3 М NaCl, Содержание углеводов в собираемых фракциях (по 1 мл ) определяют по реакции с фенолом и серной кислотой, По оси абсцисс отложен объем .выхода в 1 мп (либо номера фракций, так как объем фракций 1 мп). На фиг.8 представлен калибровочный график зависимости объема выхода декстранов от их молекулярных масс (1-2 мпн., 2 - 110 тыс., 4 — 70 тыс., 5-.40 тыс.) на колонке с сефарозой 4В (0,9х80 см).

Кривая молекулярно-массового распределения ксантана "$igma", полученная в результате градиентного центрифугирования (фиг.4д) ° точно соответствует профилю элюции ксантана при гель-хроматографии (фиг.7). Кривые молекулярно-массового распределения, полученные при градиентном центрнфугировании, являются зеркальным отражением элюционных профилей ЭПС, полученных при гель-хроматографии, так как при ,гель-хроматографии высокомолекуляр.ные фракции элюируются ранее низкомолекулярных, а при градиентном центрифугировании наоборот, т.е. высокомолекулярные компоненты содержатся в последних фракциях, ll66 8

Значение молекулярных масс отдельных компонентов ксантана, определенные методом гель-хроматографии (фиг.7 и 8) и предлагаемым методом (фиг.4д), совпадают. Таким образом, применение предлагаемого метода не снижает качества анализа микробных, ЭПС по сравнению с гель-хроматограФией.

Формула изобретения

Способ определения молекулярномассовой неоднородности микробных полисахаридов, предусматривающий приготовление раствора хлористого

15 натрия, внесение в него исследуемого образца с последующим проведением ультрацентрифугирования до максимапьного разделения образца по молекулярной массе и анапиэом полученны фрак20 ций, отличающийся тем, что, с целью расширения технологических возможностей способа за счет увеличения диапазона исследуемых молеку-

25 лярных масс, в раствор хлористого натрия перед внесением образца вводят раствор хлористого цезия в соотношении 5: 1 — .1: 1 при постоянном суммарном объеме, при этом раствор хлористого натрия имеет плотность !,03-30,, з

1,20 г/см, а хлористый цезий — I 201, 60 г/см .

3Ф

4 м ь ь ф

М

1 ф

0 10 12 И 16 18 И 22 24 26 Р И

Нокера рракций

2 4 6 д 10 12 1+ 16 18 20 22 24 26 28 ЮО

Ноиера фракций фиг.1

1451166

6 d 50 52 54 5б 1d

N yPeW55u

03 ф

03

Ц2

55 ЧЦ> 5цц»

Фив. 2 фб

03 02 с с

2 4 0 Э 50 52 54 5i 1Ю 20 22 24 20 20 РР

52 урающц52

Ф РР

3у ф 03

Й ot

0S ф

02

0,1

Ф

Ю

М 51S ф 24

М 03

3 а е

2 4 0 I a ft 54 N e

2 4 Б 8 50 52 54 50 5Р

2-4 6 О 50 52 и 50 50 20222»20Ì S0

52 уракций

2 4 6 d 50 52 54 50 50 20 22 24 2б 20 РР

Ф5бРЗ

5Р Ю©гцца

1451166

6 И Я

И И 26 И 30

Ф ураг ий !

8- fa И И bb N Ф

1б о и и Я N fb ba

Яаа5 и фракций

) 451166

Ф; ф вя

N л4

3

Ф

0$

04

0,2

2 1 Ч Ю f0 1f 1+ f6 9 О О И» И И N

Уурагций

Фиг. 6

1451166 4 ФХ ХО ХХ Мввч

Фиг. У Рю,щФ, му

Составитель З.Фалунина

Техред Л. Сердюкова

Корректор Н.Король

Редактор М.Недолуженко

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Заказ 7037/21 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5