Способ идентификации сортов сахарной свеклы

 

Изобретение относится к биохи.мическим способам идентификации сортов растений по компонентному составу белков и может быть использовано в селекции свеклы для регистрации видов, фор.м и сортов, изучения их генетической структуры. Цель изобретения - повышение точности и надежности идентификации. Отбирают семена без околоп.тодника. Каждое семя помещают в пробирку и экстрагируют суммарные белки. Затем из белкового экстракта методом криопреципитации выделяют глобулины, которые фракционируют с помощью электрофореза. Перед электрофорезом в белковую смесь вводят два дезагрегирующих агента (1°/о додецилсульфата натрия и 5% 2-меркаптоэтанола), и электрофорез осуществляют в вертикальных пластинах. 2 ил., 6 табл. о & (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„Я0„„1463190 A1 (5D 4 А 01 Н 1/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21 ) 4125635/30-13 (22) 25.07.86 (46) 07.03.89. Бюл. № 9 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт сахарной свеклы и Всесоюзный научно-исследовательский институт растениеводства. им. Н. И. Вавилова (72) Л. А. Лесневич, В. А. Борисюк, 3. A. Болелова, В. Г. Конарев, И. П. Гаврилюк и Л. Н. Зайцева (53) 631.521 (088.8) (56) Физиология и биохимия культурных растений. 1982, т. 14, № 6, с. 584 †5.

Изобретение относится к биохимическим способам идентификации сортов растений по компонентному составу белков и может быть использовано в селекции свеклы для регистрации видов, форм и сортов, изучения их генетической структуры.

Цель изобретения — повышение точности и надежности идентификации сортов сахарной свеклы.

На фиг. 1 представлено 11 типов спектров глобулинов, выявленных у 3-сортов сахарной свеклы; на фиг. 2 — эталонный электрофоретический спектр глобулинов сахарной свеклы.

Способ осуществляется следующим образом.

У изучаемого сорта отбирают 100 семян без околоплодника. Каждое семя помещают (54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ COP

ТОВ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ (57) Изобретение относится к биохимическим способам идентификации сортов растений по компонентному составу белков и может быть использовано в селекции свеклы для регистрации видов, форм и сортов, изучения их генетической структуры. Цель .изобретения — повышение точности и надежности идентификации. Отбирают семена без околоплодника. Каждое семя помещают в пробирку и экстрагируют суммарные белки.

Затем из белкового экстракта методом криопреципитации выделяют глобулины, которые фракционируют с помощbe электрофореза.

Перед электрофорезом в белковую смесь вводят два дезагрегирующих агента (1% додецилсульфата натрия и 5% 2-меркаптоэтанола), и электрофорез осуществляют в вертикальных пластинах. 2 ил., 6 табл.

2 в пробирку, тщательно раздавливают его стеклянной палочкой и заливают 0,2 м 1 М

NaC! для экстракции суммарных белков (альбуминов и глобулинов), которую проводят в течении ночи (15 в 16 ч). Затем глобулины осаждают из суммарного белкового экстракта охлажденной дистиллированной водой (методом криопреципитации).

Перед электрофорезом в белковую смесь вводят два дезагрегирующих агента: 1%-ный додецилсульфат натрия и 5%-ный 2-меркаптоэтанол. Полученные глобулины фракционируют с помощью электрофореза. Электрофорез проводят в 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Глобулины диссоциируют до полипептидов в нагретом до 100 С 0,25М трис-НС 1

1463190 буфере (рН 6, 8), содержащем 1Р/р-ный додецилсульфат натрия и 5 /р-ный 2-меркапТоэтанол. Продолжительность электрофореа 3 ч при силе тока 50 мА на пластину и апряжении 200 В. Электрофорез осущестляют в вертикальных пластинах.

В табл. 1 — 3 приведены данные результатов испытания режимов экстракции и электрофоретического фракционирования глобулинов, позволивших получить четкие и многокомпонентные спектры.

В табл. 1 приведены результаты изучения ,электрофоретических спектров, полученных, при фракционировании глобулинов семян са1харной свеклы с околоплодником и без него.

Как видно из приведенных данных, использование для экстракции глобулинов семян без околоплодника позволяет получать электрофоретические спектры более четкие и с большим числом компонентов, чем для глобулинов семян с околоплодником.

В табл. 2 показано влияние условий экст1рагирования и продолжительности электро, форетического фракционирования на полноту извлечения компонентов глобулинов из, семян сахарной свеклы сорта Белоцерковская односеменная 34.

Из приведенных данных видно что обьем экстрагирующего буфера 0,1 мл не достаточен для проявления субъединиц глобулинов с Rf 0,, 02,,0,10, 0,18, 0,21, 0,26, 0,35, 0,75. Объем — 0,3 мл — великоват, поэтому

:на электрофоретических спектрах зоны с Rf ! 0,42 и 0,64 плохо разделяются. Вместе с тем при использовании для экстрагирования бел ков 0,2 мл буфера были получены четкие электрофоретические спектры с 23 ком понентам и.

Из табл. 2 видно также, как влияет продолжительность экстракции на качество lloлучаем ых электрофоретических спектров.

Часовая и трехчасовая экстрации не достаточны для извлечения из одного семени всех субъединиц глобулинов. Только экстрагирование белков в течение ночи (15 в 16 ч) обеспечило получение электрофоретических спектров с наибольшим числом компонентов (23).

При трехчасовой (сокращенной) продолжительности электрофореза получен электрофоретический спектр с 23 компонентами. При продолжительности разгонки 7 ч часть субъединиц глобулинов свеклы (Rf 0,73, 0,76, 0,78, 0,82, 0,87, 0,92, 0,96) выходит из геля.

Следовательно, наибольшее число компонентов в спектрах обнаружено при использовании объема экстрагирующего буфера

0,2 мл, продолжительности экстракции «на ночь», продолжительности электрофореза

3 ч.

В табл. 3 представлены результаты сравнения электрофоретических спектров глобулинов, описанных известным и предлагаемым способами.

Как видно из табл. 3 электрофоретические спектры суммарных белков в нативной системе геля имеют в своем составе только

6 компонентов глобулинов: три из них основные (Rf 0,13, 0,20, 0,28), а три минорные (Rf 0,03, 0,09, 0,48). Применение одного дезагрегирующего агента (SDS) повышает разрешающую способность фракционирования глобулинов (12 компонентов). Но она все же недостаточна. Введение двух дезагрегирующих агентов — SDS и 2-меркаптоэтанола — значительно улучшает электрофоретическое фракционирование и позволяет получить четкое разделение 23 субъединиц глобулинов.

Предлагаемым способом изучено три сорта сахарной свеклы: Белоцерковская односеменная 45 (БЦ 45), Веселоподолянская 29 (ВП29), Индустриальная. В каждом сорте проанализировано от 100 до 150 семян. При этом выявлено 11 типов спектров глобулинов (фиг, 1), которые различаются числом компонентов в спектре, интенсивностью окраски и относительной электрофоретической подвижностью некоторых компонентов.

Полученные электрофоретические спектры изучаемого сорта (100 спектров) записывают в виде белковых формул при сравнении их с эталонным электрофоретическим спектром глобулинов сахарной свеклы. Эталонный электрофоретический спектр глобулинов сахарной свеклы представлен на фиг. 2, его белковая формула,с. 123 р (1)23456 g 12345678910 W 123(4) 56789.

В табл. 4 представлены белковые формулы 11 типов спектров, обнаруженных у трех сортов сахарной свеклы.

Записанные в виде белковых формул электрофоретические спектры глобулинов отдельных семян разделяют на группы по типам спектров и определяют частоту их встречаемости для каждого сорта в данной выборке семян.

Спектры изученных сортов сахарной свеклы приведены в табл. 5.

Как видно из табл. 5, сорт БЦ 45 имеет следующие типы спектров: 3. 4, 6. 7, 8, 9, !О, 11; сорт ВП29 — спектры 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8. а сорт Индустриальный — спектры l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Некоторые типы спектров оонаружены только у сорта Белоцерковской селекции — 9, 10, 11, а спектры 1, 2, 5 — только у сортов ВП29 и Индустриальный.

Из данных табл. 5 видно также что каждый сорт характеризуется неодинаковым распределением частот встречаемости основных типов спектров. Так, наиболее часто встречаемым спектром у сорта БЦ 45 является спектр 9 (35, 60 /р), а наиболее редко встречаемым — спектр 6 (4, 40Р/р), который однако у сорта ВП29 встречается чаще других (32,30Р/p). Для сорта Индустри1463190 альный наиболее часто встречаемым является спектр 1 (26, 60%).

Таким образом, каждый сорт отличается от другого не только наличием разных типов спектров, но и частотой их встречаемости. При этом каждый сорт имеет наиболее характерный для него тип спектра (наиболее часто встречаемый). Двухфакторный дисперсионный анализ показал, что различия между сортами достоверны — HCP 0,05

= 0,136.

Формула изобретения

Такая характеристика сорта может быть наглядно представлена в сортовой решетке.

В верхней графе этой решетки указаны характерные для данного сорта типы спект- 15 ров, а в нижней — частота их встречаемости в процентах (табл. 6).

Применение предлагаемого способа в селекции сахарной свеклы дает возможность четко идентифицировать сорта по частоте

Показатели

Электрофоретические спектры глобулинов семян сорта Белоцерковская односеменная 34

С околоплодником

23

Диффузное проявление

6 компонентов

Четкое проявление всех компонентов

Таблица 2

Объем экстрагирующего буфера, Показатели

L () 0,1 0,2 0,3 1 3 Ночь

3 4 7

Число электрофоретических компонентов

23 21 17

18 23 21 16 19 23

0,02 — — 0,02 0,10

0,10 — — 0,10 0,18

0,87 О, 73

0,92 0,76

0,96 0,78

Не проявляющиеся компоненты (Rr) О 18 — — О 18

0,82

0 21 — — Π23 Π26

0 26 — — Π26

0,87

0,92

0,35 — — 0,37 0 70

0,96

0,75

Число электрофоретических компонентов

Четкость электрофоретических компонентов встречаемости электрофоретических спектров глобулинов в выборке 100 семян. Способ позволяет наряду с идентификацией изучать генетическую структуру популяции, определять оригинальность и константность сорта.

Способ идентификации сортов сахарной свеклы, включающий электрофорез белковой вытяжки семян без околоплодника и последующий анализ полученных электрофоретических спектров, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и надежности идентификации, электрофорезу подвергают глобулины отдельного семени, которые выделяют методом криопреципитации, при этом перед электрофорезом в белковую вытяжку вводят два дезагрегирующих агента — додецилсульфат натрия и 2-меркаптоэтанол.

Таблица1

Продолжительность Продолжительность экстракции, ч электрофореза, ч

1463190

Продолжение табл. 2

Показатели

Объем экстрагирующего буфера, Продолжительность экстракции, ч

Продолжительность электрофореза, ч

Оэ1 092 ОФЗ 1 3 Ночь

3 (4 (7

Не разделившиеся зоны (Rf) 0,42

0,64

0,64 а б л и ц а 3

Компонен

Относительная электрофоретическая подвижность компонентов глобулинов в электрофоретических спектрах (Rf) Нативная система геля— известный способ

0,02

0,02

0,03

0,10

0,30

0,09

0,18

0,32

0,13

0,36

0,22

0,20

0,24

0,28

0,39

0,48

0,28

0,54

0,34

0,59

0,40

0,80

0,83

0,42

0,46

0,88

0,48

0,93

0,52

0,95

0,54

0,58

0,62

0,68

0,70

18

0,73

0,76

С применением одного дезагрегирующего агента (SDS) опробованное решение

С применением двух дезагрегирующих агентов (SDS и 2-меркаптоэтанол) предлагаемый способ

1463190

Продолжение табл. 3

Относительная электрофоретическая подвижность компонентов глобулинов в электрофоретических спектрах (Rr) Компоне н

С применением одного деэагрегирующего агента (SDS) опробованное решение

Нативная система геля— известный способ

0,78

0,82

0,87

0,94

Общее число компо нентов

23

Таблица 4

Основные типы электрофоретических спектров глобулинов трех сортов сахарной свеклы (белковые формулы) (Спектр

123 (1) 23456

12356789

123 (4) 5678

123 (4) 5679

12356789

123

23456 (1) (2) (3) 456 (1) 23456

123

129) 123

23(4)567(8)9 л

12356789

23456

123

° 123

235679

235679

123

123 (1) 2 (3) 45678910 12 (3) 5789 (4) 5689

1 456789

123

1235679

123457

123

23456 (1)23456 (1) (2) (3) 456 (1)(2)3456 (1)23456 (1) 23456

С применением двух дезагрегирунхцих агентов (SDS и 2-меркаптоэтанол) предлагаемый способ

2456 (7) 89 (2) 4568910 (4) 569а10 (2)45689 (2)4568910 (2) 45679а10 (2) 456910 (2) 4569

1463190, Таблица 5

Частота встречаемости типов спектра сортопопуляции

Тип

Сорт„ фактор А

l спектра фактор

II повСреднее торность

I повторность

-13, 80

-8,65

0,00

0,00

0,00

БЦ 45 1

0,00

0,00

0,00

3,93

15,57

16, 00

6,50

15, 20

3,72

6,70

6 90

-6,64

-12,34

0,00

0,00

0,00

4,40

4,40

4,00

4,80

4,70

-4, 73

1,46

4,10

13,00

35,90

23,72

8,85

13,60

4,47

6,77

6,90

6,50

0,90

14, 70

14, 50

14,90

ВП 29

2,75

5,90

5,00

6,80

5,90

6,80

5,00

0,00

17,60

0,00

0,00

18,20

32,00

17,00

32,80

32,00

5,76

5,40

6,00

5,87

17,70

18,10

17,40

0i00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

Индустриальный 1

4,71

27,00

20,60

-О, 44

13 90

2,55

2,60

-6, 11

-2, 45

2,20

1,80

2,60

2,00

2,27

7,65

13, 70

17,70

13,40

13,00

16, 50

4,40

0,04

17,17

4,46

2,75

5 00

13,60

35,30

13,00

26,20

19,40

12, 70

13,30

35,60

13,30

26,67

20,00

13,37

Эффекты уровней факторов и эффекты взаимодействий

-5,70

-2,98

10,97

15,63

-3,36

-11,88

-4,45

-2, 22

1463190

13

Продолжение табл. 5

Тип

Сорт„ фактор А спектII повСреднее торность

I повторность

0,00

2,79

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

П р и м е ч а н и е. HCP 0,05 для сравнения частных средних 0,136.

Таблица 6

Спектр (сорт ВП29) 6 7

3 5

Частота

14, 70 5, 90 5, 90 17, 60 32, 30 5, 76 17, 70 встречаемости, 1

Спектр (сорт БЦ 45) 3

8 9

4 6 7

Частота

15,57 6,70 4,40 4,40 13,30 35,60 13,30 6,77 встречаемости, ра фактор

Частота встречаемости типов спектра сортопопуляции

Эффекты уровней факторов и эффекты взаимодействий

-4,64

-6,83

1 .У 4 5 8 7 8 У Ю 71

ОЯ

022

Q,Ã4

0,88

051

042

0ФЕ а о

05с

054

058

0Я

ОЯ

0,70

0,U

0,76

0 78

ОЫ

ÎÂ7

098 а, к

Составитель L. Шкрадюк

Редактор В. Данко Техред И. Верес Корректор В. Романенко

Заказ 621/3 Тираж 6! 8 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат «Патент», г. Ужгород, ул. Гагарина, 101