Способ сортовой идентификации пшеницы
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к биохимии растений, и может быть использовано в области селекции и семеноводства пшеницы и других злаков. Целью изобретения является повышение разрешающей способности сортовой идентификации. Способ состоит в том, что сортовую идентификацию проводят после фракционирования белков зерна электрофорезом или изоэлектрофокусированием по спектрам ингибиторов химотрипсина-субтилизина. Способ позволяет идентифицировать сорта со сходными или близкими спектрами глиадина ,в частности, сорта с общей родословной, которые не всегда возможно идентифицировать традиционными методами по спектрам глиадинов.
союз советсник социАлистичесних
РЕСПУБЛИН ццг А 01 Н 1/04
ГОсудАРстВенный номитет по изовРетяниям и отнРытиям пРи гннт сссР (21) 4295318/30-13 (22) 10.08.87 (46) 15.04,89. Бюл. Р 14 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт защиты растений и
Всесоюзный научно-исследовательский институт растениеводства (72) А.В.Конарев, Н.К.Губарева, Н.А.Вилкова и В.Г.Конарев (53) 575.633. 112, 1(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР
1Ф 50727 1 ю кл. А 01 Н 1 04, 1975. (54) СПОСОБ СОРТОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ
ПШЕНИЦЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биохимии растеИзобретение относится к биотехнологии, а именно к биохимии растений, и может быть использовано в области селекции и семеноводства пшеницы и других злаков.
Цель изобретения - повышение раз решающей способности сортовой идеитификации.
Возможными путями повышения разрешающей способности сортовой идентификации являются либо увеличение эффективности фракционирования запасных белков, предел которой уже .практически достигнут, либо использование для этих целей других полиморфных систем белков. Установлено,. что белки-ингибиторы химотрипсина-субтилизина, со" держащиеся в зерне (муке), являются высокополиморфными белками, отражаю.Щ,» ЫП999 нии, и может быть использовано в об.ласти селекции и семенэводства пшеницы и других злаков. Цель изобретения — поьышение разрешающей способнос-.и сортовой идентификации. Способ состоит в.том, что сортовую идентификацию проводят после фракционирования белков зерна злектрофорезом или изоэлектрофокусированием по спектрам ингибиторов химотрипсина-субтилизина.
Способ позволяет идентифицировать сорта со сходными ичи близкими спектрами глиад.-.на в частности сорта с общей родословной, которые не всегда можно идентифицировать традицис-нными методами по спектрам Глиадинов щими сортовое разнообразие пшеницы и других злаков (например, ржи).
Способ заключается в том, чза сортовую идентификацию зерна и муки пше-ницы и других злаков гровсдят после фракционирования белков зерна электрофорезом или изоэлектрическим фокусированием IIo спектрам ингибиторов химотрипсина-субтилизина.
Способ осуществляют следующим образом.
Навески зерна, отдельные зерновкй или часть их эндосперма размалывают.
Белки извлекают из муки 4-крагным объемом воды (2 И мочевины, буфера:или другого экстрагента). Смесь центрифугируют, осадок отбрасывают. Проводят изоэлектрическое фокусирование (1ЭФ) белков в пластине бХ-ного ПААГ
1471999 толщиной 0,2-0,3 мм, содержащего 27 амфолина, сервалитов или амфолитов отечественного производства с интервалом рН 4-9.
Образцы наносят на гель с помощью бумажных полосок в объеме 5-30 мкл в зависимости от чувствительности применяемого способа выявления ингибиторов. 10
После ИЭФ в разделяющем геле выявляют ингибиторы химотринсина-субтилизина. Выявление ингибиторов может осуществляться методами, в которых используется желатиновый слой фотопленок либо искусственные аналоги субстратов протеиназ ° Поскольку данные ингибиторы бифункциональные, для проявления их спектров можно использовать любую из указанных протеиназ. Незначительные отличия между спектрами, проявленные химотрипсином и субтили. зином, связаны с присутствием нескольких компонентов специфичных ингибиторов каждого из этих ферментов. Мень- 25 шее число "лишних" компонентов наблюдается при проявлении спектров химотрипсином, однако последний можно испольэовать с ограниченным набором типов фотопленок. В свою очередь исгользование субтилизина обеспечивает несколько более высокую чувствительность анализа, более ровный фон и возможность работы со многими типами фотопленок.
По первому варианту метода выявле35 ния спектров ингибиторов на гель накладывают бумагу, смоченную раствором протеиназы в 0,1 M Иа НРО4 (концентрация химотрипсина 10-15 мкг/мл, субтилизина — 20 — 30 мкг/мп). Через
10 мин бумагу удаляют и на ее место накладывают фотопленку. Через 10-.
20 мин инкубации при 30-40 С фотопленки накладывают на влажную фильтро- вальную бумагу. Последнюю слегка подсушивают сухой бумагой и отделяют от нее фотопленку. На фотопленке ингибиторам соответствуют темные полосы на светлом фоне..
По второму методу после ИЭФ на гель накладывают фотопленку на 20 мин, затем переносят ее на бумагу, смоченную раствором химотрипсина (2"3 мкг/
/мл) или субтилизина (4-б мкг/мл) в
0,1 М Na 55 виде 30-40 мин при 30-40 С. Бумагу годсушивают листом сухой бумаги и отделяют. фотопленку. Более высокое кач.. во спектров получают при использовании в качестве поддерживающей среды вместо бумаги гель 0,87-ной агарозы, содержащей 0,1 M Na ÍÐ04 и протеиназу. Способы с использованием синтетических аналогов субстратов менее удобны из-за низкой чувствительности. Спектры ингибиторов из разных образцов .;ерна сопоставляют между собой или со спектрами из предварительно составленного каталога, Можно записать спектр ингибиторов в виде формулы, предварительно обозначив возможные позиции компонентов в спектре. Способ основан, в частности, на том, что образцы, сходные по локусам глиадина, могут отличаться по другим локусам, в частност-. " o локусам ингибиторов, если эти бразцы не полностью идентичны. Спектры ингибиторов химотрипсина-субтилизина у разных сортов и линий пшеницы, ржи и других злаков значительно отличаются по компонентному составу. Уровень различий, вь. являемых между образцами зерна, сопоставим с тем, что характерен для глиадинов, а в ряде случаев превосходит его.. Пример 1. Идентификация сортов пшеницы по ингибиторам химотрипсина-субтилизина. Зерна размалывают, белки извлекают 4-кратным объемом воды, смесь центрифугируют. ИЭФ проводят на готовой пластине 110 х 240 мм. В качестве анодного буфера используют смесь 0,04 М аспарагиновой и глутаминовой кислот, катодного — 2Х-ные амфолины с рН 9-11. Образцы наносят на гель с помощью бумажных полосок 10 х 5 мм в объеме 20 мкл на расстоянии 15 мм от анода. На пластину шириной 110 мм наносят 15 образцов. Расстояние между электродами 1б0 мм (разгонку ведут вдоль пластины). ИЭФ ведут на приборе "Мультифор П" при мощности тока 8 Вт и напряжении 2500 В в течение 2 ч. Затем на гель накладывают предварительно увлажненную фотопленку. Через 20 мин пленку снимают, высушивают и накладывают на пластину 0,8%-ной агарозы, содержащей 0,1 М Ма НРО4 и химотрипсин (4 мкг/мл). Сверху помещают гибкую 147199 Формула изобретения Способ сортовой идентификации пшеницы, включающий фракционирование белков зерна, отличающийся тем, что, с целью повышения разрешающей способности, сортовую идентификацию проводят по спектрам ингибиторов химотрипсина-субтилизина. Составитель В.Демкин Техред Л.Олийнык Корректор В,Романенко Редактор M.Петрова Заказ 1638/2 Тираж 618 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101 пластиновую;t::åíêó,-,!.ÿ предотвращения подсыхания фо опленки и агарозы. о Инкубацию ведут при 30 С в течение 35 мин. Фотопленку помещают на лист 5 влажной гладкой фильтровальной бумаги, слегка подсушивают и отделяют фотопленку. Ингибиторам соответствуют темные полосы на светлом фоне. Различные сорта пшеницы отличаются по спектра ингибиторов. По результатам анализов составляется каталог спектров ингибиторов, характерных для разных сортов, по которому в, дальнейшем сверяются при сортовой идентификации. Пример 2. Сортовая идентификация зерна у сортов, трудноразличимых по глиадинам. Сорта Саратовской группы селекции трудноразличимы по глиадинам. Саратовская 36, Саратовская 42 и Саратов9 О ская 44 практически неразличимы между собой, а у Саратовской 33 и Саратовской 39 отличия по спектру глиадинов незначительные. Зерновки разрезаются пополам. У одной половинки определяют спектр глиадинов, а у другой — ингибиторов (см. пример !). При проявлении спектров используют химотрипсин. Зерновки, не различимые по глиадинам, четко отличаются по спектрам ингибиторов.
