Способ получения меченого @ j @ -тромбина
СОН 3 СОВЕ ТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН (51)5 А 61 K 43 0
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ
flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
Н д ВТОРСНОМV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (46) 15. 10. 90. Бюл. У 38 (21) 4143946/28-14 (22) 06. 11.86 (71) Казанский государственный медицинский институт им. С.В. Курашова (72) В.Н. Тимербаев, С.В. Киселев и С.В. Киршин (53) 612.015 (088.8) (56) Greenwud, Hunter. Biochem. J, 1963, v. 89, р. 114-123. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕНОГО
" J d-ТГОМБИНА .(57) Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии и гематологии, касается нового способа получе1
Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии и гематологии и касается нового способа получения ,о(-тромбина (КФ 3.4.21.5), меченого над
Цель изобретения — повышение специфической активности o(тромбина—
tt5J
Способ осуществляется следующим образом, Выделяли протромбин из крови че« ловека. Затем иодировали его Л хлораминовым методом и активировали в среде, содержащей тканевый тромбопластин, ионы кальция, факторы свертывания крови Уа и Ха. Активационную смесь помещали на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой для отделения нетромбиновых лродуктов активации. 8-Тромбнн J очищали далее методом хроматогра-".фии.
Пример 1. Из 450мл плазмы крови человека получили 23 мг про„„SU„„1474937 А 1 ния d -тромбина (КФ 3.4.21,5) меченого г З. Цель изооретения — повыше-. ние специфической активности а -тромбина — J. Для этого выделяют про г тромбчн из крови человека. Затем кодировали его J хлораминовым методом и активировали в среде, содержащей тканевый тромбопластин, ионы кальция, факторы cBppTblBBHHR "poBH
Ja и Ха. Активационную смесь поме.щали на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой для отделения нетромбиновых продуктов активации. Далее а(-тромбин г J очищают методом хроматографии.
2 тромбина с удельной биологической активностью 1345,6 ед/мг, Полученный С протромбин метили г Л. Для этого в полиэтиленовую пробирку внесли
1,25 мп раствора протромбина с концентрацией 17,8 мг/мл в 0,1 М фосфат- р ном буфере рН 7,4. Добавили к этому раствору 0,05 мл раствора Na 2 О,f М раствора метабисупъфита натрия и 0,3 мп 0,1 М раствора иодистого калия. Для отделения протромбииа.° 1 от свободного иэотропа проводили 126 гель-фильтрацию реакционной смеси на колонке (1,6 х 15 см) с сефадек- В® сом С-25, уравновешенным 0,05 М трис- . НС1 буфером рН 7,4. Получили протромбин †J с удельной радиоактивностью 2,05х10 рас !мин/мг (669,6 Ки/Моль) и свертывающ.й активностью 549,4 ед/мг. К 14,4 мл 1474937 Составитель Г ь Вудякова Редактор Н. Козлова - ТехредА.Kравчуa, Корректор Н, Король Заказ 4362 Тираж 528 Подписное, ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям н открытиям при ГКНТ СССР f13035 Москвау Ж-35р Раушская набор де 4/5 Ыонзвадственно-издательский комбина "Патент", r.Óærîðoä, ул. Гагарина, 101 раствора протромбина — " Л в 0,05 М трис-НС1 буфере рН 7,4, содержащего 2,5 мМ СаС1, добавили 1 мп суспензии тромбопластина (35 мп/мл) и по 0,1 мл свежей плазмы и сыворотки. Активацию проводили в течение 2,5 ч при 37 С, контролируя прирост биолоо гической активности тромбина в смеси. После активации смесь центрифугировали 20мин при 7000я и 4 С, Тромбин - J очищали далее хроматографией на колонке (1,6 х 10 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,05 М фосфатным буфером рН 6,5. Фракции элюата, содержащне o(-тромбин — 5J, нанесли на колонку (0,8 х 10 см) с SP-сефадексом, уравновешенным 0,05 М фосфатным буфером рН 6,5. e -Тромбин злюировали 0,15 И фосфатным буфером рН 6,5, Получили 3 мг -тромбина — д с удельной радиоактивностью 4,18 х 10 расп/мин/мг (603,9 Ки/Моль) и со свертывающей активностью 2552,8 ед/мг, Ы Тромбин - J давал одну белковую поло И су при электрофорезе в полиакриламндном геле. Пример 2. Из 550 мл плазмы человека получили 26 мг протромбина с удельной биологической активностью 1443 ед/мо. Протромбин метили 3. как и в первом примере, используя 1,13 мп его раствора с концентрацией 22,9 мг/мл и 0,048 мп раствора. На "J с радиоактивностью 1,14 мКи. I . Получили протромбнн - Ч с удельчой радиоактивностью 4,6 х 10 расп/мин/мг 5 (1509, 03 Ки/Моль) и с биологичес. кой активностью 1022, 0,5 ед/мг. Активацию протромбина - +J и очи1 щение (-тромбина - 3 проводили также как и в первом примере. Получили 3,5 мг (тромбина — J с удельной радиоактивностью 3,3 х х 10 7 расп/мин/мг (548,7 Ки/Иоль) и со свертывающей активностью 2687,5 ед/м. Свертывающая активность с(тромбина - J 2356,8+461,1. ед/мг. Свертывающая активность о(тромбина — 3 полученного известным cao"" собом, 362,5+254,1 ед/мг. Формула изобретения Способ получения меченого J Ы-тромбина путем инкубации (-тром25,бина с раствором Na J s растворе хлорамина Т с последующей очисткой хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе и 8F-сефадексе, о т л и ч а ю щ.и йс я тем, что, с целью увеличения специфической активности, радиоактивную метку инкубируют с неактив ной формой а-тромбина — протромби- . ном и активируют его в среде, содержащей тканевый тромбонластин, ионй кальция, плазму и сыворотку крови. 
