Способ биоиндикации тяжелых металлов в морской воде
Изобретение относится к охране окружающей среды и может быть применено в контроле уровня загрязнения морской среды тяжелыми металлами с использованием макроводорослей в качестве тест-организмов. Целью изобретения является повышение точности определения, сокращение времени анализа и увеличение количества одновременно анализируемых проб. Способ заключается в том, что водоросли (тест-объекты) адаптируют в течение суток на среде с фоновым содержанием металлов при красном свете интенсивностью 300-500 лк. Затем среду заменяют исследуемыми образцами воды (опыт) и свежей исходной средой (контроль) и в течение 28-30 ч водоросли инкубируют при периодическом освещении интенсивностью 6000-8000 лк (4-4,4 ч - свет, 4-4,5 ч - темнота), после чего определяют окислительную активность среды по отношению к соответствующим исходным средам. О повышении концентрации металлов в исследуемой воде по сравнению с фоновой судят по статистически достоверному отличию окислительной активности среды в опытных и контрольных пробах. 9 табл.
союз соВетских социАлистичесних
РЕСПУБЛИК (5И 4 С 01 П 33/18
i) /
И АВТОРСКОМУ ОБИДЕ ГЕЛЬСТВУ в течение суток при красном свете Я ) интенсивностью 300-500 лк. Затем сре- QQ ду в опытных пробах заменяют на ис- а 1 следуемую воду и проводят инкубацию ф каждого вида по отдельности в течение 28-30 ч при периодическом освещении, 4-4,5 ч — свет интенсивностью
6000-8000 лк, 4-4,5 ч — темнота, В качестве физиологической характеристики водорослей, изменяющеися под действием металлов, измеряют окислительную активность среды. О повышении концентрации металлов в исследуемой воде по сравнению с фоновой судят по статистически достоверному отличию
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ по изоьРетениям и отнРытиям пРи Гкнт сссР (21) 4262410/31-13 (22) 10.04.87 (46) 15,05.89. Бюл. 1:" 18 (71) ИГУ им. М.В.Ломоносова (72) Е.Ю.Золотухина, Е,Е.Гавриленко, A.Ä.ÑèçoB и К.С.Бурдин (53) 584(088.8) (56) Полищук Р.А. Экспедиционные исследования в Средиземном море. Киев:
Наукова думка, 1969, с. 25. (54) СПОСОБ БИОИНДИКАЦИИ ТЯ)ЖЛЫХ
ГЖТАЛЛОВ В МОРСКОЙ ВОДЕ (57) Изобретение относится к охране . окружающей среды и может быть примеНепо в контроле уровня загрязнения морской среды тяжелыми металлами с использованием макроводорослей в качестве тест-организмов. Целью изобретения является повышение точности определения, сокращение времени аналиИзобретение относится к области охраны окружающей среды и может быть применено в контроле уровня загрязнения морской среды тяжелыми металлами с использованием макроводорослей в качестве тест-организмов °
Цель изобретения — повышение точности определения, сокращение времени анализа и увеличение количества одновременно анализируемьх проб.
Способ заключается в следующем.
Биомассу водорослей — тест-объектов помещают в камеру с чистой водой и проводят адаптацию растений к фоновому содержанию тяжелых металлов
Я0,„, 1479876 за и увеличение количества одновременно анализируемых проб. Способ заключается в том, что водоросли (тестобъекты) адаптируют в течение суток на среде с фоновым содержанием металлов при красном свете интенсивностью
300-500 лк, Затем среду заменяют исследуемыми образцами воды (опьгг) и свежей исходной средой (контроль) и в течение 28-30 ч водоросли инкубируют при периодическом освещении интенсивностью 6000-8000 лк (4-4,4 ч свет, 4-4,5 ч — темнота), после чего определяют окислительную активность среды по отношению к соответствующим исходным средам, О повышении конценчрации металлов в исследуемой воде по сравнению с фоновой судят по статистически достоверному отличию окислительной активности среды в опытных и контрольных пробах. 9 табл.
1479876 окислительной активности среды B опытпь3х и контропт ных вариантах.
П р и и е р 1. Водоросли помещак3т в чистую морскую воду пр33 весовом соотношении биомассы и среды (1: 500).— (1:400). Пробы инкубируют в течение суток в темноте, при красном свете различной интенсивности и при обычном искусственном освещении (7000 лк) .
Затем все пробы водорослей в течение суток содержат при освещенности
7000 лк и после инкубации определяют величину окислительной активности (OA) среды.
В табл. 1 приведены результаты определения OA н среде водорослей, адаптирован33ь3х в темноте, при красном свете различной интенсивности и при обычном искусственном освеще33пи (7000 лк) в течение 24 ч и затем осI вещаемых в течеш3е суток (7000 лк), Иэ табл. 1 видно, что режим проведения адаптации не отражается на среднем уровне окислительной активности среды, но существенно сказывается на ваРиабельности результатов.
Наименьшие величины коэффициента вариации (С3 1 наблюдаются при использовании красного света интенсивностью 300-500 лк.
Пример 2. Водоросли инкубируют в морской воде с добавлением солей металлов (концентрация 0,5 мг/л по металлу) в течение сутбк при различном режиме освещения, Затем биомассу отполаскивают, высушивак3т, оэоляют в концентрироваш|ой азотной кислоте и определяют содержание металлов в тканях растений атомно-абсорбционным методом.
В табл. ? приведены результаты определения различий в содержании тяжелых металлов в талдомах водорослей, инкубированных в течение 24 ч на среде с фоновым уровнем металлов и их повьш3енной концентрацией (500 мкг/л) при разном режиме освещения, Как видно из табл. 2, наибольшее увеличение содержания металлов в пробах водорослей наблюдается при чере.— довании 4-часо33ого освещения и 4-часовой темноты.
Пример 3. Водоросли ипкубируют в морской воде при периодическом освещении ра 333о331 интенсивности.
В табл. 3 приведены средние значения OA среди 33 норм» для 30 видов
40 водорос 33ей, инкубирова нш 3х при и ериодическом освещении (4 ч — свет, 4 ч— темнота) разной интенсивности в течение 28 ч после предварительной адаптации на красном свету.
Для всех исследованных водорослей освещенность 7000 лк обеспечивает достаточно высокий уровень OA в норме, необходимый для проведения индикации металлов в среде по изменению
ОА. Повышение освещенности сверх этого значения хотя и повышает уровень
ОА, но у многих видов водорослей вызывает разрушение пигментного аппарата.
Пример 4, Водоросли, очищеннь3е от обрастаний, помещают в сосуды с чистой морской водой при весовом соотношении биомассы и среды 1:500 и инкубируют при красном свете 400 лк в течение 8-48 ч. Затем в сосудах заменяют среду, при этом часть проб заливают вновь чистой водой, а часть— водой с добавлением соли меди (500 мкг/л по металлу) и инкубируют о в течение 28 ч при 18-19 С периодическом освещении 7000 лк (4 ч — свет, 4 — темнота), После окончания инкубации определяют окислительную активность как отношение скоростей окисления ДОФА в средах, содержащих водоросли, к скорости окисления ДОФА в соответствующих исходных средах.
В табл. 4 приведена окислительная активность среды водорослей с фоновой (фон) и повышенной (изб.) концентрацией меди; средние значения (М) и их среднее квадратическое отклонение (S) для 5 биологических повторностей в каждом варианте.
Как видно из табл, 4, в среде водорослей, адаптировавшихся в течение
8-12 ч, наблюдаются значительные колебания OA затрудняющие сопоставление данных в вариантах с различной концентрацией меди. Средние значения
ОА остаются в целом постоянными, но для получения статистически достоверных различий между вариантами при малых сроках адаптации необходимо болыное количество повторностей. Разброс данный у водорослей, адаптированных в течение суток, существенно уменьшается и при более длительных сроках адаптации практически не изменяется. Таким образом, оптимальный срок адаптации водорослей — 24 ч, более длительная адаптация не отражает5
14 ся существенно на результатах анали за, но увеличигает общее время его проведения. Использование 24-часовой адаптации водорослей при слабом красном свете позволяет уменьшить число повторностей для каждого варианта до 2 — 3.
Пример S, Биомассу водорослей, подготовленную аналогично опи-+ санному в примере 4 и адаптированную в течение суток при красном свете
400 лк, помещают в среды с фоновым уровнем металлов и в среды с солями меди, цинка или кадмия (200 мкг/л по металлу) и инкубируют при периодическом освещении (4 ч — 7000 лк, 4 ч темнота), Пробы среды отбирают через
12, 20, 28, 36 и 44 ч (нечетное количество чередований световых и темновых периодов, так как отбору проб должен предшествовать световой период) . Определяют ОА в среде водорослей по отношению к соответствующим исходным средам и рассчитывают разность
ОЛ (ОЛ).
В "àáë. 5 приведена g ОЛ () при разнь.х сроках инкубации водорослей в морской воде с добавлением солей металлов (200 мкг/л по металлу); среднее (11) и среднее квадратическое отклонение (S) для 5 биологических повторностей.
Как видно из табл. 5, в первые
12-20 ч инкубации водорослей на среде с металлами наблюдаются значительные колебания отклика, связанные с неодновременным завершением в. отдельных повторностях первой фазы токсического эффекта — повьш ения метаболической активности, приводящего к некоторому увеличению ОА. К 28 ч инкубации токсическое действие данной концентрации металлов на водоросли проявляется в основном в значительном снижении 0А среды, достоверно регистрируемом даже при небольшом количестве повторностей. Продолжение инкубации практически не отражается на качестве получаемых результатов.
Пример 6. Разные виды водорослей, предварительно подготовленные аналогично описанному в примере 4, инкубируют в течение 28 ч при периодическом освещении (4 ч — 7000 лк, 4 ч — темнота) на среде с фоновым содержанием металлов и средах с добавлением солей меди, цинка, кадмия
79876 6
55 свинца и никеля (200 мкг/л по металлу). Определяют ОА по отношению к соответствующим исходным средам и рассчитывают P,ОА.
Результаты определения ДОА для разных видов водорослей после инкубации в течение 28 ч приведены в табл. 6, среднее значение для 5 биологических повторностей.
Из табл. 6 видно, что исследованные виды водорослей различаются по чувствительности к отдельным металлам. Учитывая, что стандартное отклонение средних значений ХОЛ, приведенных в таблице, не превышало 25 окислительной активности, можно считать, что достоверная индикация концентрации металлов 200 мкг/л достигается при абсолютнойг величине ОА, превьш ающейг 100 В табл. 6 представлены значения Д ОЛ, соответствующие этому критерию и выделяющие наиболее чувствительные виды водорослей, перспективные для индикации более низких концентраций тяжелых металлов в морской воде, Специфичность чувствительности водорослей к отдельным тяжелым металлам позволяет, используя соответствующие наборы видов, не только констатировать факт повышения концентрации тяжельгх металлов в среде, но и идентифицировать конкретные элементы, входящие в комплексное загрязнение.
Пример 7. Биомассу каждого вида водорослей, характеризующихся спегГггфической чувствительностью к отдельным металлам или нескольким из них, адаптируют и инкубируют аналогично описанному в примере 6. Испытываемыми образцами служат растворы солей металлов в морской воде (концентрация около 200 мкг/л по каждому из металлов).неизвестного состава.
В табл. 7 приведены результаты оп- ггеделения ДОА (среднее для трех биологических повторностей для каждого вида, среднее квадратическое отклонение не превышает 25% окислительной активности). В табл. 7 указаны также элементы (на основании данных, часть которых приведена в примере 6), которые могут в каждом отдельном случае вызывать отклик данного знака и величины (знак "+"), и элементы, наличие повышенных концентраций которых в образце воды отрицается характером отклика (знак "-").
1479876
Лнализируя даннь1е табл. 7, можно сделать следующие выводы:
В образце 1 присутствуют медь и цинк наличие других элементов в по9
5 вьпненных концентрациях вызывает сомнение, так как не подтверждается реакцией большинства видов.
В образце 2 в повышенных концентрациях могут находиться свинец, цинк и кацмий, наличие меди и никеля маловероятно.
В образце 3 повышена концентрация кадмия, никеля и цинка и маловероятно превы1пение меди и свинца над фа новым уровнем.
В анализируемых образцах воды с помощью атомно-абсорбц11онной спектрофотометрии по стандартной методике определяют содержан11е мед11„1111111ca „ кадмия, свинца и никеля.
В табл. 8 1гриведeиы конце llтpaции тяжелых металлов в испытываемых средах по данным атомно-абсорбционнаго анализа среднее для 4 аналитических 25 повторностей, стандартное отклонение не вьппе 5%, Таким образом, в1п1ады о повышении концентрации металлов в среде, сделанные иа основе анализа с применением предложенного способа, совпадают с результатами атомно-абсорбционного анализа проб воды.
Таким образом, использование на- 35 боров различных видов водорослей, обладающих разной чувствительностью к отдельным металлам, дает возможность не только констатировать факт повышения их концентрации, но и вы- 40 явить отдел1.н11е металлы.
Пример 8. Наиболее чувствительные к тяжелым металлам при их концентрации 200 мкг/л виды водорослей подготавливают к анализу и инку- 45 бируют на средах с металлами аналогично описанному в примере, Используют следующие концентрации металлов, фон, мкг/л: 5, 10, 50, 100,. После инкубации определяют 0А среды водорослей по отно1пению к соответствующим исходным средам и рассчитывают Л ОЛ по отношению к OA фоновой среды.
В табл, 9 приведена ЕОА среды водорослей при различной концентрации металлов, среднее (tl) и среднее квадратическое отклонение (S) для
3 биологических повторностей, Как видно иэ табл. 9, субтоксические кОнцентрации металлов (меньше
100 мкг/л) могут вызывать у водорослей увеличение ОА (ЛОА положительная, см. также табл. 7), которое достоверно регистрируется и наряду со снижением.ОЛ, наблюдаемым при более высоких концентрациях металлов, может быть показателем реакции водорослей на изменение уровня металлов в среде.
Таким образом, предложенный способ позволяет повысить чувствительность и сократить время анализа, уменьшить трудоемкость определения, объемы анализируемых образцов среды при одновременном увеличении количества одновременно испытываемых проб воды, I
Формул а изобретения
Способ биоиндикапии тяжелых металлов в морской воде, предусматривающий помещение в камеры с чистой водой и инкубацию тест-объекта — макроводорослей, адаптацию их к фоновому содержанию тяжелых металлов, деление камер на две группы — опытные и контрольные, добавление в опытные камеры с макроводорослями исследуемой воды, измерение физиологической характеристики водорослей, их сравнение и заключение о повышенном содержании тяжелых металлов в исследуемой воде по сравнению с фоном при статистически достоверном отличии значений физиологической характеристики тестобьекта в опыте по сравнению с контролем, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, сокращения времени анализа и увеличения количества одновременно анализируемых проб, адаптацию проводят в течение суток при красном свете интенсивностью 300-500 лк, инкубацию в исследуемой воде проводят по отдельности каждого вида тестобъекта в течение 28-30 ч при периодическом освещении: 4-4,5 ч свет интенсивностью 6000-8000 лк, 4-4,5 ч— темнота, в качестве физиологической характеристики измеряют окислительную активность водорослей, а в качестве тест-объекта используют Cladophora stimpsonii, и/или Chaetomorpha moniligera, и/или Еп егашогрйа
intestinalis, и/или Grateloupia dichotoma, и/или Ceramium ciliatum, и/или Loureusia hybrida и/или Cyctoseira barbata, при зтам для свинца
9 14798 тест-объектами являются Ulva fenestrata, и/или Sargassum pallidium, и/или Gelidium latifolium, для цин1 ка — Bryopsis adriatica, и/или Gra5
teloupia turuturu, и/или Fntегоmorpha prolif era, для кадмия — Tichocarpus crinitus, и/или Cladophora vagabunda, и/или Ge l id ium c r ina1 å, и/или
Ceramium rubrum, для никеля — Clado76 I0
phora stimpsonii, и/или Sargassum
pallidum, и/или Dictyopteris divaricata, и/или Bryopsis adriatica, и/или
Cladostephus virticillatus, для меди — Ulva fenestrata, и/или Grateloupia turuturu, и/или Dictyota dichotoma, и/или Dictyopteris divaricata, и/или Callitamnion granulatum, и/или Padina pavonia.
Таблица 1
Вид водорослей
ПокаОА при следующем режиме адаптации затели
7000 лк темнота красный свет, лк
1 1
400 1000 2000
Ulva Fenestra- И
ta С
703 700
299 21
0,43 0,03
458 456
161 15
0,35 0,03
705 7 I 1
98 193
0,14 0,27
442 445
84 128
О, 19 0,28
Sargassum
pallidum
Сч
"1 — среднее и S — среднее квадратическое отклонение для 10 биологических повторностей.
Т а б л и ц а 2
МеВиды водорослей
Разность накопленной и исходной концентраций металлов при следующем режиме освещения, мкг/л талл темнота постоянное чередование света и темноты освещение
7000 лк
12:12 4:4 2:2
M+S
M+S M+S M+S
M+S
42
41
14
18
11
21
17
202 + 23
207 + 18
10+ 1
99 + 12
84 + 25
245 + 21
262 + 12
80 11
99+ 15
131 + 18
Entегоmorpha
linza
Sargassum pal1Ыцтп
П р и м е ч а н и е, Среднее (М) и среднее квадратическое отклонение (S) для 8 биологических повторностей.
Си 1?О «+
Zn 111 «+
Са Е+
Ni 60 ++
РЬ 58 +
Си 192 +
Zn 181 +
Cd 48 «++
Ni 66 +
РЪ 79 +
48 108 +
33 99 +
2 6 +
21 54 +
12. 52 +
12 190
13 163 ++
i1 43 +
14 65 +
17 75 +
162 «+ 38
173 + 11
6+ 1
61 «+ 18
68 «+ 15
201 + 12
199 «+ 17
56+ 15
71+ 12
90+ 14
254
0 4l
412
0 38
154 + 14
161 «+ +16 . 5 2
65 4 14
72 + 11
204 «+ 15
203 «+ 9
59 + 13
83 + +12
93 11
1479876
Та блица 3
Показатели Окислительная актинность (Я) при освещенности (лк) 500 1000 2000 4000 7000 10000
125 211 253 264 406 521
15 82 124 121 215 312
+S
Таблица4
0A(%) при длительности адаптации водорослей (ч) Виды нодорослей
Величина
8 12
24 36 48
1 фон изб. фон. изб, фон изб, фоп изб. фон изб.
95 330 88
76 186 71
162 443 154
88 211 81
97 312 99
79 181 76
118 443 109
81 196 82
78 321 79
14 15 13
150 459 153
18 17 14
93 314 96
8 13 12
110 441 108
15 16 14
Г! 326
+Я 248 и 450
+S . 312
И 305
+S 251
H 440
+S 319
$а гga s sum pal1. i clum
Суз (.аз е .ra barbaCa
Ceramium ei l iaCum
Cladophnra зC mpsonii
325 75
15 20
448 139
18 21
306 95
17 20
445 112
21 22
328
461
315
439
Таблица5 при инкубации в течение (ч)
2о (f (вОА() Виды водорослей Уе- Велиталл чина
28 36 44
Sargassum pa 1.—
11dum
Си
С? ае отпогр(1а
monilegra
Chaetomnrpha
moni1igera
Си
Си
С1.aclîðhîrà vagabunda
И
S.
И
И
И
И
Г(S
Г(8
S
ГТ
-80
23
+12
61
+2
31
-20
49 —.61
4, +2
63
-45
41
+2
61 — 18
38 — 193
48 — 11
-63
-141
-83
-87
-163
-51
49 — 162
-292
20 — 189
-198
-208
-?42
-199
-246
-199
-282
-295 -299
18 2.3
-183 -192
15 19
-201 -208
18 12
-2.1 4 -209
18 20
-240 -233
13 18
-200 -202
17 21
-253 -252
18 11 †1 -200
11 * 12
-288 -289
14 18
14
1479876
Таблица 6
Виды водорослей
ЬОА
Металлы Г
-219
-184
+53 — 134
+268
+21
-17
+170
+127
-17
+106
-280
-221
+143 — 120
-23
+29
+52 — 14
+1.3 7
-21
+151
-141
-179
-17
-81
-121
-292 — 176
-201
-139
-21
+35
+46
-44
-109
+40
--67
-209
-35
-20
+122
+160
-92 — 177
+ 146
-115
-116
-24
+97
-2
+92
-74
+44
-227 +40 -39
-47
-2 +507 +182 +125
+218
+64
-56
-309
-79
+79
-109
-76
-28
-10
-57
-193
-247
-75
-360
-139
-195
+211
+150
+430
-167
+277
+175
+54
+34
-8
+24
+96
-282
+61
+210 — 146
-159
-39
+62
+33
-76
+249
+138
+10
-75
-21
-213
-153 — 186
-24
-124
-109
-124
-287
-281 †4
-168
-199
-124
-22
-154
-199
-15
-143
+33
-42
-78
-30
-98
+78
163
-150
-359
Таблица7
Виды водорослей
ЬОА, 7
Обр аз ец
ОА элементы ЬOA элементы ЬОА элементы
Sargassum pallidum
Bryopsis adriatica
-341
-200 — 121
+386
-Ni
-108
-281
+158 +Ni,-Cu, ÐÚ
+290 +Zn
+Cu
+Cu
+Pb Cu
+Zn -Cu
Tichocarpus crinitus
Cladophora vagabunda
-211
-294
+Cu
+Cu +Cd — 114 +Cu +Cd
-224 +Cu +Zn +Cd
+Cu +Cd
+Cu,+Cd
U1va fenestrata
Entегоmorpha linza
Cladophora stimpsonii
Chaetomorpha monil.igera
Tichocarpus crinitus
Rhodomela larix
Gracilaria verrucosa
Сга е1oupia turuturu
Sargassum pallidum
Pel.vetia wrightii
Dictynta dichotoma
Dictyopteris divaricata
Entегоmorpha intestj.—
nalis
Entегоmorpha prolifera
Ulva lactuca
Bryopsis adriatica
Cladophora vagabunda
Gelidium latifolium
Grateloupia dichotoma
Gelidium crinale
Ceramium rubrum
Callitamnion granulatum
Ceramium ciliatum
Laurensia hybrida
Cystoseira barbata
Cladostephus verticillatus
Padina pavonia
Cu Zn РЪ Ni
1 5
1479876
Продолжение табл. 7
6ОА, Ж
Виды водорослей
Образец
A 0A элементы Ь OA элементы ОА элементы
-152
-199
-229
-382
Сг- 9+
+Cu, +Cd
+Cu
+Cu — l41 — 162
+18
+229 — 144 +Cu, +Cd — 171 +Cu +Cd
+108 +Ni Ñu
+235 +Zn,+Cd,-Cu
+Cu +Cd
+Cu, +Cd
— Cu Ni
+Zn +Cd
-Ni,-Cu
-Cu Ni
-Cu
+Гр,-Си
+Zn
+Zn
+Cu +Nx
+Cu
+Си
+/ . n
+Zn — 161
-342
-286
+141
+407 — 15
+18
+131
+129
+511 — 128 +Cu +Ni
-14 -Cu
+31 -Cu -Pb
+141 +Zn
+419 +Zn
Та блица 8
Образец цинк кадмий свинец никель медь
Исходггая среда (фогг)
2
4,89
206,42
214,35
208,14
0 51
218,23
0,52
0,56
0,03
0,03
209, 13
216 11
3, 11
3,18
199,68
3,12
1;27
1,22
1,21
203, l9
Таблица9
Велицигга
ЛОА
Концентрация металлов, мкг/л
) t 50
5 10
100
Сеl dium cri.nalå
Сеглпп.um гн?г г um
Dictyopteris di.varic.
Grateloupiл dicl>otoma
Cladostep?»rs ver i.ciI
Pad i.na pavîn.гл
ULva f:enestrata
Сдлс)1.aria verrucовл
Entегоmorpha 1п еst..
Виды водорослей . Металл
Sargassum pallidum
Chaetomorpha тпо-.
ni1igera
Chaetomorpha
moniligera
Chaetomorpha
moni1igera
Sargassum pallidum
Chaetomorpha
moniligera
Chaetomorpha
moni1igеглМ. +100
S 15
И +75
S 18
М +8
Б 39
М вЂ” 130 — S 28
+. +
Б 14
М -5
8 18
l7 -80
S 19
+120
+130
+283
79 — 100
+30
+50
26 — 136
+150
+85
+393
-198
+208
+229
11 — l 50
+200
+89
-30
-188
-30
-50
-210
