Способ получения целлюлаз

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в лесной, целлюлозно-бумажной, текстильной промышленности и сельском хозяйстве. Цель изобретения - повышение выхода целлюлаз. Способ предусматривает выращивание продуцента TRICHODERMA VIRIDE на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода лигноцеллюлозные виды сырья, выбранные из отходов промышленности или сельского хозяйства, или твердый остаток этих отходов, подвергнутый обработке целлюлозами, причем соотношение целлюлозы и лигнина устанавливают от 3:2 до 1:3, содержащие чистой целлюлозы в среде 0,65-1,35 мас.%. Выход целлюлаз повышается в 1,4-4 раза. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Ь

Г

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4271847/31-13 (22) 30, 06.87 (46) 07.07.89. Бюл. Р 25 (71) Институт биохимии им.А.Н.Баха о и Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) E.Ñ.Ìoðîçîâà, Л.И.Сажина, М,Л.Рабинович, А.С.Селиванов, А.М,Морозов, Т.И.Ширшова, А.А,Клесов, М.Л.Яковлева и Н.Н.Смертин (53) 663.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

И- 1127900, кл. С 12 N 9/42, 1983, Авторское свидетельство СССР

И 1070161, кл. С 12 N 9/42, 1982.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения целлюлаз культивированием грибовпродуцентов, и может быть использовано в лесной, целлюлозно-бумажной, текстильной промышленности и сельском хозяйстве.

Целью изобретения является повышение выхода целлюлаз, Способ предусматривает использование только труднометаболиэируемых источников целлюлозы, прошедших предварительную обработку с удалением легко метаболизируемых фракций сахаров, при оптимальных для биосинтеэа целлюлаэ (5!) С 12 N 9/42//(С 12 N 9/42, С 12 R 1:885) 2 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в лесной, целлюлозно-бумажной, текстильной промышленности и сельском хозяйстве, Цель изобретения — повышение выхода целлюлаз. Способ предусматривает выращивание продуцента

Trichoderma virid на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода лигноцеллюлозные виды сырья,- выбранные иэ отходов промышленности или сельского хозяйства, или твердый остаток этих отходов, подвергнутый обработке целлюлазами, причем Соотношение целлюлозы и лигни- ф на устанавливают от 3:2 до 1:3, содержание чистой целлюлозы в среде от 0 65 до 1,35 мас.7, Выход целлюлаз повьппается в 1,4-4 раза, 1 э.п, ф-лы, f табл. Ь

Ф» соотношениях целлюлозы и лигнина от

3:2 до 1:3 и содержании чистой целлюлозы в среде 0,65-1,35 мас.Х,. Эти источники целлюлозы являются труднораэрушаемыми в природе лигноцеллюлозными отходами промьппленности и сель ского хозяйства (целлолигнин) либо могут быть получены из них или более богатых целлюлозой материалов путем их частичного гидролиза целлюполити» ческими фрагментами.

Способ осуществляют следующим образом, В качестве продуцентов используют штаммы Trichoderma virid Б7 и t3/10, В ид сырья Соотношени среде, 7а

Средняя активность целлюлаэ,ед,/ип

Опыт

Штамм

F-79

Число экспеШтамм

F-120

Число эксперииентов рииентов лнгнин

12,7+4

16,0 2

3. 1 1,13

2:1 1,13

20,521

1 0, 13 19, 3 3

1,13 19,1+1

3r2

3:2

21,5

28,8т7

22,5+5

110,35

1, 13

22+6

19+4

20,5

1+О, 13

1,3

1:1

° 2

110, 13 33+11! ° 2

1О

19,9+О, 1 3

1 0, 13

1+0,13

1:3

1:4

19,5+5

13,3+5

11

6,4а0,4 2

12,9-2 20

1+0 13 4,6+0,2

1;4

13,5-2

30 жои

П р и и е ч а и н е. 1 — сучковая целлюлоза производства лесопромышленного комплекса; 2 — холоцеллюлоза нэ стеблей хлопчатника (гуэапая); 3 - отход переработки бумаги н картона для текстильных патронов фабрики бумажно-технических иэделий; 4 - осажденный бентоннтои нэ сточных вод отход производства конденсаторной бумаги бумажной фабрики; 5 — кислотно-осахаренная древесно-волокнистая масса производства целлюлозно-бумажного комбината; звездочкой обозначены виды отходов после обработки целлюляэаии (для снижения содержания целлюлозы). депонированные но Всесоюзной коллекции промьш пенных микроорганизмов и имекщие соответственно регистрационные номера ВКПИ и F-79 и RKIIN F-120.

Культуры продуцентон выращивают на скошенной агаризонанной среде

Роулен-Тома н течение 5-6 сут, Ферментационная среда содержит н своем составе источник углерода н виде целлюлозосодержащего отхода, органический источник азота и необходимые минеральные соли. Ферментационную питательную среду засевают водной суспензией конидий со скошенного агара из расчета 1О конидий/мл сре6 ды. Культивирование осуществляют н .колбах Эрленмейера объемом 750 мл при рабочем объеме среды 100 мп н условиях аэрации на круговых качалках, вращающихся со скоростью 200

Непровар (1)

Холоцеллюлоза (2)

Бумажная пыль (3)

Холоцеллюлоза

Бумажная пыль

Непровар

Мелкое волокно (4)

КОДВМ (5)

Буиажняя пыль

Мелкое во% локно

Непровар

Мелкое воw локно

Свекловичный

491886

220 об/мин, в течение 144- 192 ч при

28-30 С.

Активность целлюлолитических фер5 ментов определяют по степени гидролиза фильтровальной бумаги Ватман Ф 1, Количество образующихся редуцирующих сахаров определяют методом ШомодиНельсона. Целлюлолитическую актив1р ность выражают в миллиграммах глюкозы, образующейся н реакционной смеси при действии на субстрат 1 мл неразведенного фильтрата культуральной жидкости (ед/мп), а также н между15 народных единицах целлюлолитической активности (MF./ìë).

Таблица иллюстрирует средние достигаемые значения активности для различных видов лигноцеллюлозного сырья

20 при реализации предлагаемого способа на двух штаммах Т,vi ride, 1491886

Сопоставление данных таблицы показывает, что наиболее высокие выходы целлюлаз для обоих штаммов (в 1,54 раза выше, чем для базового объекта, опыт 13) наблюдаются при использовании различных видов лигноцеллюлозных отходов или их остатков после обработки целлюлазами до достижения соотношения целлюлозы и лигнина от

3:2 до 1:3 (предпочтительно от 1: 1 до 1:2). Как повьппение (опыты 1 и 2), так и понижение (опыты 11 и 12) этого соотношения приводит к ухудшению выхода ферментативной активности несмотря на то, что во всех случаях уравнивается содержание чистой целлюлозы в среде культивирования. Установлено, что при использовании приготовленных указанным BblIUe способом лигноцеллюлоэных материалов в среде культивирования содержалось не свьппе

0,025 г/л растворимых сахаров, тогда как при использовании свекловичного жома их концентрация в среде состав— ляла 1,8 г/л.

Пример 1 (контроль), Для осуществления процесса биосинтеза целлюлолитических ферментов конидиями штаммов Т.viride 13/10 или Б7 засевают ферментационную среду следующего состава, мас.7:

Свекловичный жом 4,0

Пшеничные отруби 5,0

КН,Р04 0,2

МКБ04 0,06

МН4С1 0,6

Солодовые ростки 1,43

Вода — водопроводная, рН вЂ” натуральный, Культивирование осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 мл при объеме среды.100 мл. Оптимальная о температура ферментации 28-30 С. Через 144 ч уровни целлюлолитической активности составляют, ед. /мл (МЕ/мл):

Штамм 13/10 (F-120) 12,9 (1, 19)

Штамм Б7 (F-79) 12,9 (1, 14)

Пример 2. Процесс ферментации осуществляют в тех же условиях, что и в примере 1, но вместо свекловичного жома используют обработанную целлюлазами холоцеллюлоэу гуэапаи при соотношении целлюлозы и лигнина

3:2 и содержании в среде чистой целлюлозы 1,13 мас.7. Через 168 ч уровни целлюлазной активности составляют, ед./мл (ME/ 1J1):

Штамм 13/10 20, 3 (1, 9)

Штамм Б7 16,9 (1,65)

Пример 3, Процесс ферментации осуществляют в тех же условиях, что и в примере 1, но вместо свекловичпого жома используют мелкое волокно отход производства конденсаторной бумаги при соотношении целлюлозы и лигнина 1:1 и содержании чистой целлюлозы в среде 0,9 мас.Х для штамма

13/10 и 1,13 мас.7 для штамма Б7.

Через 192 ч уровни целлюлазной активности составляют, ед./мл (ME/мл):

Штамм 13/10 24,1 (2,2)

Штамм Б7 28,2 (2,6)

Пример 4, Процесс ферментации осуществляют в тех же условиях, что и в примере 1, но вместо свекловично— го жома используют бумажную пыль (отход бумаги для текстильных патронов), обработанную целлюлазами при соотношении целлюлозы и лигнина 1:2 и содержании чистой целлюлозы в среде

0,9 мас.7. Через 168 ч уровень целлюлазной активности для штамма 13/ 10 составляет 46, 1 ед./мл или 4,3 ME/ìë, Пример 5 ° Процесс ферментации осуществляют в тех же условиях, что и в примере 1, но вместо свекловичного жома используют мелкое волокно отход производства конденсаторной бумаги — после обработки целлюлазами при соотношении целлюлозы и лигнина

1:3 и содержании чистой целлюлозы в

3 среде 1,13 мас.7. Через 192 ч уровень целлюлазной активности составляет, ед./мл (МЕ/мл):

Штамм 13/ 10 25,5 (2,3)

Штамм Б7 20,0 (1,9)

Пример 6 (опытнопромышленные испытания). Ферментацию проводят в ферментере рабочим объемом 9 м на среде того же состава, чту и в примере 1, эа исключением того, что пшеничные отруби используют в концентрации 0,57, а вместо свекловичного жома в ферментер загружают 117 кг по сухому весу бумажной, пыли, предварительно обработанной целлюлаэами, при соотношении целлюлозы и лигнина 1: 1 и содержании чистой целлюлозы в ферментере 0,65 мас,7. Посевной материал — 5 колб поверхностной культуры штамма Т.vi ride 13/ 10. Время активации на качалке 13,5 ч. Продолжительность выращивания посевного материала в инокуляторе 22,5 ч, объем инокулята 1 м, исходный рН среды 5,25.

1491886 чить в тех же условиях и эа то же время выход целлюлаэ в 1,7 раза выше при использовании более дешевого,сырья — остатка ферментативного гидролиза бумажной пыпи.

Формула изобретения

2, Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что в качестве продуцента используют штамм Trichoderma

viride ВКПМ F-79 или Trichoderma

viride ВКПМ F-120, Составитель И.Привалова

Редактор В.Петраш Техред Л.Сердюкова Корректор М.Васильева

Заказ 3827/27 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул ° Гагарина, 101

Через 121 ч уровень активности штамма

13/10 "-2,6 ед./мл или 2,1 ME/ìë при среднегодовом уровне на среде с жомо (ба- QBbN Объект) 13 2 ед /мл или 5

1,2 МЕ/мл.

В примерах 4-6, где используется обработка целлюлазами для получения целлолигнина необходимого состава, применятся глубокий гидролиз фермент- 10 ными препаратами целлобранином, целлокандином, целловиридином из расчета 20 ед./г сырья в течение 48-72 ч при 45-50 С с последующим тщательным отмыванием образующихся сахаров до концентрации менее 0,0027. Обработанное ферментами сырье фактически может являться отходом ферментативного получения сахаров.

Таким образом, предлагаемый способ 20 позволяет повысить выход целлюлаз в

1,5-4 раза, утилизировать трудноразрушаемые лигнифицированные отходы промышленности и сельского хозяйства и заменить кормовое сырье — свекло- 25 вичный жом.

3а базовый объект принят способ получения целлюлаз, используемый на биохимическом заводе и включающий культивирование продуцентов целлюлаз - 0 грибов Trichoderma viride (Т, reesei ) на среде того же состава, что в примере 6, за исключением того, что в качестве источника углерода используется 4Х-ный жом.

По сравнению с базовым объектом предлагаемый способ позволяет полу1. Способ получения целлюлаз, предусматривающий культивирование грибов

Trichoderma spp - продуцентов целлюлолитических ферментов на питательной среде, содержащей целлюлозосодержащий источник углерода, источник аэота— пшеничные отруби и солодовые ростки, минеральные соли и воду при оптимальной температуре культивирования до достижения максимальной активности, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целлюлаз, в качестве источника углерода используют лигноцеллюлозные виды сырья, представляющие отходы lIpoMbIIILlleHHocTH или. сельского. хозяйства, или твердый остаток этих отходов, подвергнутый обработке целлюлаэами, при этом соотношение целлюлозы и лигнина устанавливают от 3:2 до 1:3, содержание чистой целлюлозы в среде — от 0,65 до

1,35 мас.7,