Способ определения количества реакционных центров фотосистемы-2 растений

 

Изобретение относится к физиологии фотосинтеза растений и может быть использовано в исследованиях пигментного аппарата фотосистемы-2 растений. Цель изобретения - повышение точности способа, достижение его универсальности и сокращение времени анализа. Для этого в анаэробных условиях проводят спектрофотометрические измерения фотоиндуцированных изменений поглощения образцов, приготовленных из целых клеток низких растений, или образцов хлоропластов и субхлоропластных препаратов высших растений, причем в качестве показателя количества реакционных центров фотосистемы-2 используют количество феофитина - промежуточного акцептора фотосистемы-2. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (l9) (l1) (5l) 4 А 01 G 7/00

<"" 1 г, л (1" 1., ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4335245/30-13 (22) 30.11.87 (46) 23.07.89. Бюл. Н 27 (71) Институт почвоведения и фотосинтеза АН СССР (72) В.В.Климов, С.И.Аллахвердиев, С . К. Жармухамедов и В .А.Шувалов (53) 54 1.144 .7(088 .8) (56) Proc Natl Acad Sci USA, 1980. v. 77, М - 8, р,4712-4716. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА

РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ ФОТОСИСТЕМЫ-2

РАСТЕНИЙ (57) Изобретение относится к физиологии фотосинтеза растений и может быть использовано в исследованиях

Изобретение относится к биохимии, биофизике и физиологии фото— синтеза растений, а именно к способам определения количества реакционных центров (РЦ) растений, и может бьггь использовано в исследованиях структурно-функпиональной организации пигментного аппарата фотосистемы-2 (ФС-2).

Известный способ применим только для хлоропластов и субхлоропластных препаратов, обогащенных ФС-2, высших растений и субхлоропластных препаратов ФС-2 низших растений и требует значительных затрат времени.

Целью изобретения является повышение точности способа, достижение его универсальности и сокращение времени анализа.

Пример 1. Для определения количества Рll, ФС-2 суепенэию клеток.пигментного аппарата фотосистемы-2 растений. Цель изобретения — повышение точности способа, достижение его универсальности и сокращение времени аналиэа. Для этого в анаэробных условиях проводят спектрофотометрические измерения фотоиндуцированных изменений поглощения образцов, приготовленных из целых клеток низких растений, или образцов хлоропластов и субхлоропластных препаратов высших растений, причем в качестве показателя количества реакционных центров фотосистемы-2 используют количества феофитина промежуточного акцептора фотосистемы-2. 3 табл. водоросли помещают в среду, содержащую 15-20 мм трис-НС1 буфер (рН 7,8), 35-40 мМ NaC1, 2 мМ Mg01 и инкубируют при комнатной температуре в присутствии 0,17 тритона Х-100 в течение 2-3 мин для нарушения целостности клеточной мембраны. Затем в аликвоте определяют концентрацию хлорофилла (ХЛ) в 80",-ном ацетоне для вычисления величины фотосинтетчиской единицы (ХЛ/РЦ) .

Спектрофотометрические измерения фотоиндуцированных изменений поглощения образца проводят в аназробных а условиях. Для этого 2 мл полученной реакционной смеси помещают в Ь кювету (1 = 1 см) . Для создания анаэробных условий гуда же вносят избыток 10 мМ 1Ь-D(+)-гэ.юкоэы и 50 ед/мл глюкозооксилазы Sigma) из расчета, что 1 ед глюкозооксилаэь окисляет

1494880

1 мкМ P-D(+) -глюкозы с одновременным поглощением 22,4 мкл О /мин. Для разложения образовавшейся И О на

Н О и О одновременно вносят

1000 ед/мл каталазы иэ расчета, что

1 ед каталазы разлагает 1 мкМ Н О в 1 мин. Образовавшийся О вновь поглощается глюкооксидазой. Через 30—

40 с после окончания реакции созда- 10 ния анаэробных условий проводят спектрофотометрические измерения фотоиндукцированных изменений поглощения образца (dA) при 685 нм, связанных с фотовосстановлением феофитина. Из- 15 менения dA феофитина при 684 нм проводят на двухлучевой фосфороскопической установке. Мощность зондирующего света 50 эрг см с, мощность

-2 действующего света 2,8 10 эрг см х 20 х с - . Точность измерения составляет 10 ед. оптической плотности, Концентрацию феофитина вычисляют по формуле Бугера-Ламберта-Бера (Э

Е С L), коэффициент экстинкции для феофитина при 685 нм составляет

0,32-10 М см

Полученные результаты представлены в табл.1.

Пример 2. Хлоропласты выделяют из 10-14-дневных проростков гороха на холоду при (О+4) С. Для о этого 50 r листьев разрушают в гомогенизаторе (MPW-324) в течение 2 — 35

3 с в среде, содержащей 0,35 М NaC1

0,02 М трис-НСI буфер (рН 7,8) и

2 мг/мп аскорбата натрия. Фильтрат, полученный после отжимания массы через полотно в восемь слоев марли, 40 центрифугируют в течение 1 мин при

1000 об/мин, осадок отбрасывают, а супернатант вновь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант (обломки хлоропластов) от- 45 брасывают, а осадок целых хлоропластов ресуспендируют в среде, содержащей 15 мМ трис-НС1 буфер (рН 7,8)

35 мМ NaCI, 2 мМ М С1 . КОнцентрацию хлорофилла определяют в SOT-ном ацетоне. Определение количества РЦ

ФС-2 в хлоропластах проводят как в примере 1.

Полученные результаты представлены в табл.2.

Пример 3. Вьщеление фрагментов хлоропластов, обогащенных

ФС-2, проводят по известной методике.Хлоропласты тщательно суспендируют в среде, содержащей 0,07 M фосфатный буфер (pH 7,0), 0,5 М сахарозу и 0,035 М NaC1. Затем вносят в реакционную смесь 17-ный раствор дигито нина для разрушения хлоропластной мембраны. Затем полученную суспензию обрабатывают на ультразвуковом диспергаторе УЗДН (22 кГц, 400 Вт, 1 мин), чтобы получить фрагменты хлоропластов с одинаковой степенью нарушенности мембран и после добавления NaCI (до 27) инкубируют на ледяной бане при энергичном перемешивании в течение 40 мин. Гомогенат центрифугируют 15 мин при 4000xg, садок отбрасывают, а к супернатанту быстро добавляют тритон Х-100 до конечной концентрации 0,1-0, 15Ж и вновь центрифугируют при 20000xg в течение 45мин.

Фрагменты хлоропластов собирают и ресуспендируют в среде, содержащей

15 мМ трис-НСI буфер (pH 7,8), 35 мМ

NaC1 и 2 мМ MgCI . Измерения проводят,как в примере 1.

Полученные результаты представлены в табл.3.

Из табл.1-3 видно, что, используя предлагаемый способ, можно определять количество РЦ ФС-2 и в целых клетках, и в хлоропластах, и в субхлоропластных препаратах, т.е. предлагаемый способ является универсальным.

Использование предлагаемого способа определения количества РЦ ФС-2 растений по сравнению с известным способом обеспечивает повышение точности анализа до 94-98Х (по известному способу 77-78X) сокращение времени анализа до 24 мин (по известному способу 164 мин),.достижение универсальности (анализ можно проводить на целых клетках низших растений, хлоропластах и субхлоропластных препаратах высших растений), как следствие сокращения времени анализа достигается сохранение более высокоактивного физиологического состояния образца.

Формула изобретения

Способ определения количества реакционных центров фотосистемы-2 растений, включающий вьщелеиие хлоропластов, ресуспендирование их в буфере, определение концентрации хлорофилла с последующим спектрофотометрическим измерением фотоинду80

6 . !Гр инне ф птОинГ1 . !в!ро2>анныу и 4!!е!и ни!! по;!оп!ечи,«бра зца !", ов; д г предварительно созданных анлэробных уc ч овиях, а количество р с а кционных цен, pos определяют по феофитину.

5 с!

4948 обтем, споцированных изменений поглощ< ния резца,отличающийся что, с целью повьппения точности соба, достижения его универсальн сти и сокращения времени анализа о5 изТаблица!

Концентрация феофиФото- Отклосин- нение тети- каядочес- го поОтклонения ка кдого полученного значения от

КвадвадрАт тклонеИсходная концентрация Хл

Опыт эменения рат ия, /Х-А/ отклонения

/Х-А/

Nx10 мкг/мл тина (конкая лученного центрация РЦ), Мх! 0 едисреднего, Х-А

Х-2,735 ница, значеХЛ/РЦ ния от средне го

/Х-A/

X-394

Целевые клетки

1, 13 0,9 2,813

1 09 0 9 2 8!3

1, 11 0,9 2,813

1,01 0.8 2,5

1, 11 0,9 2,813

1,08 0,9 2,8 13

097 08 25

1, !3 0,9 2,813

0,006

0,006

0,006

0,055

0,006

0,006

0,055

0,006

403 9

387 7

395 1

404 10

395 1

384 10

388 6

403 9

Таблица 2

Квадрат откло»

ФотосинтетичесОтклонениее каждого поОткчонення капдого полученноГО 9 на чения от среднего, /Х-А/

Х-2, 538

Квадрат откло» кения

/Х-А/

Концентрация феофитина (концентрация PI1), мл10 а

Опыт Исходная концентрация XJl г/ип Ил10 нения

fХ-А/ кая пученного единица, ХЛ/РЦ значения от среднего, /Х-А/

X-32!

Хлоропластн

3,468 0,07

3,750 0,212

3,468 0,07

3,468 0,07

3,468 0,07

3,750 0,212

3,468 0,07

3,468 0,07

323

314

326, 328

3!4

328

1,11 1,!

1,21 1,2

1,09 1,1

1,13 1,!

1,14 1,1

1,18 1,2

1,11 1,!

1,!2 1,1

1 10,2

2 9,8

3 10,0

4 9,1

5 10,0

6 9,7

7 8,7

8 10,2

1 10,0

2 10,9

3 9,8

4 10,2

S 10,3

6 10,6

7 10,0

1091 погло щения (ЬА) при

685 нм х х10

Изменения погло,щения (4A) при

685нм л л10

0,078

0,078

0,078

0,235

0,078

0,078

0,235

0,078

0,004

0,0449

0,004

0,004

0,004

0,0449

0,04

0,04

2

5

7 !

81

49

-1 !

36

4

49

49

49

1494880

Tаблица3

Отклоне- Квад- ФотоИсходная концентрация, ХЛ

Опыт зменения вадрат тклония каж- рат синдого по- откло- тетинения, / Х-А/

-5 мкг/кп Мх10 лученного значения от нения

/ Х-А/ ческая единица, среднего, /Х-А/

Х-10, 717 среднего

/Х-А/

Х-102

ХЛ/РЦ

Составитель А.Сизов

Редактор Н. Рогулич Техред А. Кравчук Корректор Л.Бескид

Заказ 4139/E Тираж 621 Подписное

ВНУШИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.ужгород, ул. Гагарина, 101

1 10,0

2 10,1

3 10,2

4 10,5

5 10,7

6 10,0

7 10,1

8 10,0 поглощения (ЬА) при

685 нм х х10

1,11 3,5

1,12 3,6

1,13 3,5

1,17 3,6

1,19 3,6

1,11 3,5

1,12 3,5

1,11 3,5

Концентрация феофитина (концентрация РЦ), Мх10

Субхлоропластные

10,938 О, 221

11,250 0,533

10,938 0,221

11,250 0,533

11,250 0,533

10, 938 01221

10,938 0,221

10,938 0,221 препараты

0,0488 101

0,2840 100

0,0488 103

0,2840 104

0,2840 106

0,0488 101

0,0488 102

0,0488 101

Отклонение каждого по лученного значения от

4

4

16

0