Способ изомеризации глюкозы во фруктозу

 

Изобретение относится к производству фруктозы путем ферментивной изомеризации глюкозы. Цель изобретения заключается в уменьшении образования псикозы и других несахаров в процессе изомеризации и повышение содержания фруктозы в растворе. Способ изомеризации глюкозы во фруктозу предусматривает контактирование исходного раствора с содержанием 40-50 мас.% глюкозы, например гидролизата крахмала, с термически стабилизированной глюкозоизомеразой при PH 6,0-7,0. Процесс изомеризации проводят при 90-115°С мин до превращения по крайней мере 54-58% глюкозы во фруктозу. Для изомеризации глюкозы следует использовать химически стабилизированную глюкозоизомеразу. 1 з.п. ф-лы, 11 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (1!) (51) 4. С 13 К 11 00

6ЛИШЩ

Ю.":;1 3; =. ;".ИЩЦ

, л Б:1Л С I Е г А

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

> (ф4

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 3615602/30-13; 3612252/30-13 (22) 30.06.83 (31) 393848; 393845 (32) 30.06.82 (33) US (46) 15.11.89. Бюл. Ф 42 (71) Набиско Брэндэ, Инк. (US) (72) Норман Е.Ллойд и Роберт

О.Хорват (US) (53) 664.165(088.8) (56) Патент США У 23821082, кл. 195-31, 1974.

Патент США У 4308349, кл. 435-94, 1981.

Патент США - 3956066, кл. 195-31, 1976. (54) СПОСОБ ИЗ01ПРИЗАЦИИ ГЛ10КОЗЫ

ВО ФРУКТОЗУ (57) Изобретение относится к проиэИзобретение относится к производству фруктозы путем ферментативной изомериэации глюкозы.

Цель изобретения — уменьшение образования псикозы и других несахаров в процессе иэомеризации и повышение содержания фруктозы в растворе.

Способ иэомериэации глюкозы во, фруктоэу заключается в следующем.

В качестве исходного раствора используют раствор, содержащий 4050 мас.% глюкозы, например гидроли. зат крахмала. Предпочтительными являются ферментативные способы получения гидролизатов, содержащих глюкозу.

Наиболее предпочтительными являются способы, которые используют соводству фруктозы путем ферментативной иэомеризации глюкозы. Цель изобретения заключается в уменьшении образования псикоэы и других несахаров в процессе изомериэации и повышение содержания фруктозы в растворе. Способ иэомериэации глюкоэы.во фруктозу предусматривает контактирование исходного раствора с содержанием

40-50 мас.% глюкозы, например гидролиэата крахмала, с термически стабилизированной .глюкоэоиэомераэой при рН 6,0-7,0. Процесс изомериэации проводят при 90-115 С в течение 1025 мин до превращения по крайней мере 54-58Х глюкозы во фруктозу. Для иэомериэации глюкозы следует использовать химически стабилизированную глюкозоизомеразу. 1 з.п. ф-лы>

11 табл. четание ферментов, например глюкоамилазы и фермента, отщепляюшего боковые цепи. Особенно предпочтительными являются сочетания ферментов, спо собных одновременно превращать ожиженный крахмал в глюкозу плюс фрук тозу, например сочетание глюкоамилазы, пуллуланазы и глюкоизомераэы.

Этот способ дает возможность получить иэомеризованные гидролизаты, . . содержащие 48Х фруктозы и 50Х глюкозы в расчете на сухую массу, ко:торые идеально подходят для дальнейшего превращения до 53-60Х фруктозы по предлагаемому способу. Можно . также использовать мембранный процесс для удаления полисахарида иэ

1523056

55 гидролизата крахмала, получая фракции, содержащие глюкозы более 99Х, что является идеальным исходньм материалом для предлагаемого способа, Растворы глюкозы, полученные кристаллизацией из гидролизатов крахмала, также являются исходным материалом.

Глюкозные и/или глюкоза-фруктоэные растворы, которые используют в качестве исходных материалов, нужно предпочтительно очищать, на какойлибо стадии их получения во избежание вредного воздействия неуглеводных примесей на глюкозоизомеразу .и для минимизации окрашивания во время температурной иэомеризации по предлагаемому способу. Можно использовать неочищенные гидролиэаты крахмала, однако, при условии, что будут выполнены условия их получения, описанные,в патенте CllJA N- 4376824.

В случае использования раствора, содержащего только глюкозу в качестве субстрата для предлагаемого способа, можно также использовать раствор глюкозы, в котором часть глюкозы уже изомеризована во фруктозу. Так, например, раствор иэомеризованной глюкозы, содержащий вплоть до 52Х фруктозы, можно обработать предлагаемым способом для повышения концентрации фруктозы до более желательного уровня выше 52Х, и предпочтительно до уровней 55-56Х и выше.

Растворы глюкозы,. содержащие фруктозу в количествах менее 50 мас.X от углеводородов, можно получить известными способами.

В качестве средства для предотвращения избыточного окрашивания во время высокотемпературной изомеризации можно добавить к глюкознофруктоэному сырьевому раствору вещества, образующие бисульфит. Предпочтительно исключить кислород из всех растворов, которые могут контактировать с глюкозоиэомеразой во время высокотемпературной реакции иэомеризации для того, чтобы свести к минимуму любое окисление фермента, которое могло бы привести к инактивации..

Глюкозоизомеразу, которую используют в качестве фермента или как источник фермента для химической стабилизации, можно выделить иэ известных микроорганизмов, вырабатывающих

35 глюкоэоиэомераэу, включая: Streptoшусея flavorires, Streptomycea.

achromogenes, Streptomyces echina»

tus, Streptomycea alЪия, Streptomyсея vedmorensis, Streptomyces.pha-

rochromogenes, Streptomyces, bobiliae, Streptomyces olivochromogenes Streptomycea епеяие1ае, АсгоЪас1ег acrogenea АсгоЪас1ег cloacae, Bacillus

coagulans Вас х11ия megat,er ium Bacillus fructosus, Acetobacter oxydans, Acetobacter яиЪохуйапя, Acetobacter roseus, Acetobacter melanogenus, Lactobacillua fermenti, Lacto bacillus brevis, LactoЪас 11ия 8а оnii, Lactobàñil1us lycopersici, Lactobacillus mannitopoeus, Lactobàñi1lus pentoaceticus, Paeudomonas Ы6rophilia, Brevibacterium pentaaminoac dicum, Escherichia intermedia, Leuconostoc mesentегоidea, Paracolobactrum aегоgenoides.

Кроме того, можно использовать глюкоизомеразу, которую вырабатывают род БосагЖа, Micromonospora, MicroЪiярога, Microelloboapora u

Arthrobacter streptomyces вид АТСС

21175. Она является прекрасным источником глюкоэоизомеразы для использования в предлагаемом способе.

Кроме того, можно использовать глю I козоизомераэу,которая обладает стабиль1 ностью при относительно высоких тем-: пературах изомеризации, например глюкозоизомеразу, продуцируемую

Bacillus stearot,hermophilus в частности штамм, выбранный из группы, „ состоящей из Bacillus stearother.—

mophilus АТСС 21365, MBRL В-3680, NRHL В-3681 и ИНВА Б-3682, глюкозоизомеразу, продуцируемую микроорганизмами рода Ampullariella, например Ampullariella digitata, Ашрц11аriella lobata, Ampullariella companulet.à и йври11агiella regularis глюкозоизомеразу,продуцируемую Bacillus licheniformis, глюкозоизомеразу, продуцируемую Thermophilus.

Кроме вышеуказанных микроорганизмов предлагаемый способ предусматривает использование их мутантов и вариантов. Мутанты-гены глюкозоизомеразы, выбранные для такого. применения, являются такими, которые обеспечивают получение глюкозоиэомеразы, которая стабильна при повышенных о температурах, особенно свыше 90 С и предпочтительно вплоть ло около

5 152

1)5 С. Такие гены можно голучить с е помощью обычных методик, которые используют для мутаций микроорганизмов, например облучением или с помощью хиыических мутагенов. В другом варианте выделенные гены глюкозоизомеразы, которые продуцируют глюкозоизомеразу промежуточной термостабильности, так, например продуцируемые некоторыми штаммами Streptomyces, могут быть годвергнуты мутации in

vitro, Выбор соответствующих генов-мутантов либо в родственные, либо в другие микроорганизмы сопровождается реинтродукцией генов-мутантов, с последующим ростом и репликацией микроорганизма и проверкой термостабильности полученноч глюкозоизомеразы.

Предполагается также, что для получения глюкозоизомеразы повышенной термостабильности, подходящей для химической стабилизации и использования в изобретении, можно использовать методику рекомбинантной ДНК.

Если аминокислотная последовательность тримерных (третичных) структур глюкоэоизомераэы известна, то можно развить повышенную стабильность с помощью точечных специфических мутаций в гене изомераэы для получения ферментов, сконструированных для содержания повышенного количества таких аминокислот, которые придают повышенную стабильность структур.

Предполагается, что такие искусственно созданные ферменты должны быть особенно полезны в предлагаемом способе.

Так как глюкоэоиэомераэу продуцируют внутриклеточно с помощью тех или иных микроорганизмов, источником глюкозоизомераэы может быть просто сбор клеток, а затем фермент можно выделить из клеток известными способами, например клеточным аутолиэисом, разрушением ультразвуком, и использовать в ферментаторе обычного известного типа. Предпочтительно, чтобы глюкозоизомераэу или химически стабилизированную глюкоиэомеразу можно было иммобилизовать на инертном носителе в соответствии с обычной и хорошо известной методикой.

Материалы и способь1, которые используют для иммобилизации ферментов1хорошо известны. Также предусмотрено присутствие небольших количеств катионов кобальта, марганца и магния

3056 6 и/нли водорастворимой соли сернистой кислоты, например сульфита натрия, бисульфита натрия, сульфита магния, 5 и/или бисульфита магния для снижения или ингибирования денатурирования глюкозоизомеразы во время осу. ществления процесса.

Необходимо, чтобы концентрация углеводорода в исходном глюкозосодержащем сиропе была в интервале

40 — 50K глюкозы по массе.

Необходимо также вести изомеризацко при рН в интервале от около 6,0 до около 7,0 и наиболее предпочтительно между 5 и 6,5. Проведение изомериэации существенно ниже или выше укаэанных значений рН приводит к образованию избыточных количеств

20 нежелательных побочных продуктов, например псикоэы, органических кислот, окрашенных продуктов, предшественников окрашенных продуктов, диангидридов фруктозы и тому подобное.

25 Было обнаружено, что рН для опти-, мальной активности глюкоэоиэомеразы заметно снижается при высоких температурах. Для глюкоэоиэомераэы из

Streptomyces rubigennsus оптимальная активность наблюдается при рН 8,69,2 при 25 C pi- 6.9-7,5 при 75 С и

5,6-6,2 при 125 С, т.е. с повышением температуры иэомериэации оН иэомеризации можно снижать для поддержания максимальной активности фермента и, 35 кроме того, для предотвращения образования побочных продуктов..

Для предлагаемого способа время контактирования предпочтительно ограничено временем, необходимым для достижения конечной концентрации, по крайней мере от около 53 до около 60 мас.7. фруктозы в расчете на полное содержание углевода, присут45 ствующего в реакционной смеси. Так как глюкозосодержащий сырьевой сН роп может содержать практически одну только глюкозу, т.е. либо мало, либо вовсе Не содержать фруктозы, или может содержать .глюкозу наряду с количествами фруктозы вплоть до около 507., время реакции зависит от природы исходного сиропа. Так эффективным является время контактирования i0-25 мин.

Еще одним необходимым требованием предлагаемого способа в случае использования химически стабилизированного фермента является длитель1523056 ность контактирования глюкоэосодержащего исходного сиропа и химическая стабильность глюкозоизомеразы., Предпочтительное время контактирования глюкозоиэомераэы или хими5 чески стабилизированной глюкозоизомеразы и глюкозосодержащего сиропа зависит в значительной степени от рН, при котором проводят реакцию изомеризации..В нижнем пределе интервала рН время контактирования может быть более длительным без нежелательного разложения глюкозы и фруктозы за счет образования. В верх- )5 нем пределе интервала необходимо более короткое время контактирования во избежание образования псикозы и окрашивания. На практике, полное время пребывания глюкозесодержащего 20 сиропа при или около окончательной температуре реакции оценивается как время эффективного контактирования, так как происходящие реакции разложения сахаров являются нефермента- 25 тивными и происходят независимо от того, контактирует сироп или нет с глюкозоизомераэой; Поэтому, при проведении изомеризации при температуре свыше 90 С важно снизить время, 30 а необходимое для доведения сиропа глюкозы до нужной температуры изомеризации (например, смешивая сироп с паром непосредственно перед контактированием с изомеразой), а после достижения нужного уровня фруктозы быстро отделить сироп от активной изомеразы и затем, как,можно быстрее, охладить сироп до температуры менее

90 С, и предпочтительно до темпера- 0 а туры менее 70 С. Если используют растворимую ферму глюкозоиземеразы или химически стабилизированной глюкозоиэомеразы, необходимо ее инактивировать (например, снижением РН до предела, при котором происходит инактивирование изомеразы) перед стадией. охлаждения во избежание обратного превращения в глюкозу фруктозы, образовавшейся на стадии высокотем" пературной изомеризации, так как реакция изомеризации является, естест-венно, обратимой.

Максимальная степень конверсии глюкозы во фруктозу, которой можно достичь„ определяется термодинами55 ческим равновесием между глюкозой и фруктозой, которое, в сваю очередь, зависит от температуры, при которой проводят изомеризацию. Очень тщательный анализ равновесных смесей глюкозы и фруктозы приводит к следующей взаимосвязи:

F = 100 К (K + I); (i)

Т + 273 + 2,3005, (2)

755 где F — - % фруктозы при равновесии в расчете на полный вес глю" козы и фруктозы;

Т вЂ” температура проведения реакции изомеризации

К вЂ” константа равновесия глюкозы от фруктозы.

Реальное время контактирования между глюкоэосодержащим сиропом и изомеразой в реакторе можно в общем оценить путем сравнения следующей формулы, если используют реактор, содержащий иммобилизованную форму изомеразы, (3)

rpe t — действительное время контактирования;

С вЂ” концентрация глюкозы и фруктозы;

V — свободный объем жидкости . в слое насадки (объем слоя минус объем, занимаемый частицами иммобилиэованного фермента);

F — доля фруктозы в глюкозе е (фруктозной смеси при равновесии при температуре иэомериэации);

F, - доля фруктозы (в расчете на

Г + Ф) при гоступлении в слой насадки;

F - доля фруктозы (в расчете на

Г + Ф) в растворе, находящемся в слое насадки;

К - константа скорости реакции изомеризации в условиях иэомеризации;

А — активность иземераэы в слое насадки.

Значения К для нммобилизованной изомеразы, полученной в соответствии с приведенными далее примерами, находятся в интервале ет около 0,07 до около 5 г ч IGIU при температу-1 -1 1523056 рах от 90. до 150 С соответственно.

Это соотношение показывает необхо- димость минимизапии времени контактирования при высоких температурах

5 при использовании слоев насадки с высокой активностью на единицу объема.

Слои насацки, -полученные по способу, описанному в дальнейших примерах, могут, содержать вплоть до 2000

ХСШ/мл, что может привести к достижению 99,5Х.-ного равновесного содержания фруктозы за менее, чем 1 мин в высокотемпературном реакторе, когда используют постадийные реакторы при различных температурах,. и сырье, подаваемое в первый реактор, изомеризуют при низкой температуре перед изомеризацией при высокой температу-тором pearcTope. Когда испол? зуют систему постадийных реакторов, предпочтительно использовать способ ферментативного превращения глюкозы во фруктозу, который включает контактирование глюкозосодержашего исходного сиропа, содержащего от 40 до

50 мас.Ж глюкозы, с глюкозоизомеразой при температуре от 20 до 80 С, при рН.от 6 0 до 9,0 и времени контактирования от 0,5 до 2 ч для превращения от 40 до 45 мас,K. присутствующей в сиропе глюкозы во фруктозу, повышая температуру изомеризационной

О среды . „от 90 до 115 С, устанавливая нужное значение рН изомеризационной среды в,интервале от 6,0 до

7,0, осуществляя контактирование фруктозосодержащего сиропа с глюкозоизомеразой в течение дополнительного промежутка времени от 10 до

25 мин для повышения степени конверсии от 53 до 60 мас.7 глюкозы, находящейся в исходном сырьевом глюкозосодержащем сиропе, причем практически без образования псикозы или других сахаров, которые не являют45 ся Глюкозои или Йруктозои, Поэтому использование высокоактивных слоев насадок может привести к малым эффективным промежуткам времени контактирования, которое, в свою очередь, минимизирует разложение фруктозы, которое происходит при высоких температурах, необходимых для проведения предлагаемого способа, При выборе методики иммобилизации глюкозоизомеразы предпочтительно, чтобы использовались способы, которые дают возможность получать мел755

2 3 б — Ы 2731 () Я

К =

100 - F

10000(1 + С)

Q(100-P) (6) где Т вЂ” температура изомеризации, о

F — равновесное содержание фруктозы (X в расчете на кие пористые частицы катализатора с тем, чтобы ингибирование эффектов диффузии иэомеризации было минимальным.

В другом варианте изомеразу можно иммобилизовать в порах мембраны, через которую пропускают раствор глюкозы во время высокотемпературной изомеризации, как средство промотирования хорошего контакта между ферментом и субстратом, минимизируя диффузионные ограничения. Носитель, который используют для иммобилиза« ции, является предпочтительно полно" стью нераствор иым и инертным для того, чтобы избежать образования нежелательных примесей. илн разло жения глюкозных (фруктозных) компонентов растворов субстратов, °

Однако, в коммерческой практике, содержащие фруктозу сиропы не изготавливают из чистой глюкозы. Чаще в качестве источника глюкозы используют гидролизаты крахмала. Они постоянно содержат сахариды,.отличные от глюкозы и фруктозы (здесь И далее именуемые полисахаридами), которые получаются в результате неполного гицролиза крахмала и обратного превращения глюкозы. Обычно они составляют от 3 до 8% в расчете на сухую массу в виде сахаридов, полученных гиДролизом крахмала. Поэтому необходимо при оценке температуры, при которой следут проводить изомеризацию, учесть все полисахариды, содержащиеся в глюкозном сиропе, также как и другие факторы. как полный вес фруктозы в сухом виде, который должен быть достигнут, образование псикозы и других продуктов, которые не являются глюкозой или фруктозой, во время эффективного времени контактирования сиропа глюкозы и изомеразы. Уравнения для расчета температуры изомеризации приводятся ниже:

1523056

3

6

95,7

99,1

104, 3

108, 9

113,8

124;3

136,1 поющое содержание глюкозы + фруктозы) при. температуре Т;.

И - Ж фруктозы в расчете на су-: хую массу, требуемый в продукте изомеризации;

С - Х псикозы + других.продук-,, тов разложения, образующихся во время эффективного изомеризационного времени кон тактирования;

Q, - Ж равновесия, достигнутый во время реакции изомериэацииу

Р - Х содержания полисахарида в глюкозном сиропе.

Обычно, менее 1%, предпочтительно менее 0,5Х, псикоэы и других продук-. тов разложения может образовываться, и поэтому может быть достигнуто 99,5%,20 равновесия. Поэтому для получения сиропа, содержащего 55,5Х фруктозы, (.в расчете на сухую массу), необходимы следующие температуры изомеризации для глюкозного сиропа указанной концентрации полисахаридов;

Полисахариды в си- Температура ропе глюкозы, Х в иэомеризации, расчете на сухую С. массу

Приемлемая коммерческая продукция содержит, в среднем, 55,5Х фруктозы в расчете на сухую массу.

Это так, потому что при этом уровне фруктозы получают кукурузный сироп с высоким содержанием фруктозы, оди45 иаковой сладости с сахарозой по массе в расчете на сухую массу. Кроме того, сироп с содержанием фруктозы

55,5Х принят как коммерческий продукт, который используют взаимозаменяемо частично илн полностью вместо сахарозы во многих пищевых продуктах и особенно в газированных мягких напитках.

Иэ-за сложностей, сопровождающих поставку, хранение, измерение и включени . сиропа в пищевые продукты, существует общая потребность в установлении стандарта для продуктов, 1

12 полученных от разных изготовителей с тем, чтобы продукты из различных источников можно быпо использовать взаимозаменяемо и одновременно. Поэтому уровень фруктозы 55-56% в расчете на сухую массу приобретает особое значение как целевой уровень в технологии, связанной с изготовлением сиропа.

В соответствии с предлагаемым способом можно получать уровни фруктозы по крайней мере 53Х предпочтительно по крайней мере 54% и более предпочтительно по крайней мере 55Х.

Продукт, полученный по этому способу, характеризуется также приемлемой окраской, которая, естественно, очень желательна, так как это снижает затраты на очистку.

Учитывая указанные требования рН и времени контактирования известный способ изомеризации глюкозы можне соогветствующим образом приспособить к работе при температуре от около 90 до 1 15 С и предпочтительно от около 100 до около 110 С для получения высококонцентрированных

Глюкозо фрук Гоэных сиропов е

При желании с учетом использовачия раствора, содержащего только глюкозу в качестве субстрата для предлагаемого способа, можно также использовать раствор глюкозы, в котором часть глюкозы уже изомеризована во фруктозу. Так, например, раствор изомериэованной глюкозы, содержащий вплоть до 50Х фруктозы, можно обработать в соответствии с предлагаемым способом, для повышения концентрации фруктозы до более желательных уровней выше 50% и предпочтительно до уровней 55-56% и выше.

Раство ры глюкозы „содержащие фруктозу в количествах менее 50 мас.% углевода, можно получить известными способами.

Учитывая вышеизложенное требование к концентрации глюкозы, рН и времени контактирования, известные способы изомеризации глюкозы можно соответствующим образом приспособить для работы в интервале температур от о около 90 до около 115 C,nредпочтительно между около 100 и около 110 С, для получения сиропа с высоким содержанием глюкозы-фруктозы.

13!

523056

Термостабильность глюкозоизомеразы может быть существенно повышена за счет одной или более химических обработок фермента с сохранением его приемлемой активности. Обрабо танный таким образом фермент называют химически стабилизированной изомеразой.

Химическую стабилизацию изоме". разы осуществляют рядом различных способов, которые могут привести к повышению термостабильности. Основное достижение состоит во вве-. дении структурных элементов в молекулу фермента таким образом„ чтобы фермент был устойчивым к раскрытию при нагревании выше его обычной точки термоденатурирования. Предпочтительным способом для осуществления этого является модификация фермента химическими замещениями на нем фрагментов, содержащих полимеризуемые вннильные группы, таким образом, чтобы последние были прочно присоединены к поверхности молекулы фермента в .нескольких местах. После этого модифицированный фермент смешивают с одним или более полимеризуемыми,винильными соединениями вводныхх растворах и полученную смесь сополимеризуют до образования. химически стабилизированного фермента, в котором фермент прочно связан . во многих точках с трехмерной полимерной матрицей, которая образовала структуру, соответствующую по форме структуре фермента.

Важно при проведении вышеописанных реакций, чтобы условия, которые приводят к денатурированию изомеров с последующей потерей активности, были обойдены. Так например, следует избежать экстремальных значений рН и температур во время любых манипуляций, необходимых для проведения вышеуказанных реакций.

Примерами реагентов, которые используют для модификации изомеразы для замещения полимеризуемых виниль-. ных групп на ней, являются акрилохлорид, метакрилохлорид, акролеин, кротоновый альдегид, малеиновый ангидрид, 3,4-эпоксибутен, 2,3-эпоксипропил сложный эфир акриловой кислоты, 2,3-тиоглицидилавый сложный эфир акриловай кислоты, 1-аллилокси-3(Nэтиленимин)-2-пропанол, О-сукциними. довый сложный эфир акриловой кислоты, ангидрид хлормалеиновой кислоты, азид малеиновой кислоты, 3-бромпропен и аллилизотиоцианат, Такие сое5 динения могут взаимодействовать со свободными аминогрунпами изомераэы, например эпсилонаминогруппой лизинового фрагмента.

Другие. соединения, которые могут взаимодействовать со свободными группами карбоновых кислот ийомеразы, могут быть использованы для замещения легко полимеризуемых винильных фрагментов на ней, Примерами винильных соединений, которые можно сополимеризовать с модифицированной изомеразой, являются акрилат натрия, метакрилат натрия, акриламид, оксиэтилметакрилат, I

20 акрилоилпиперидин-4-спиро-2 -(1 3 1 диокмакрилопентан), 1-акрилоил-4пиперидин и акрилоилметоксиамин.

Обычно. предпочтительными являются растворимые мономеры или смеси мономеров, которые цают в результате водорастворимые полимеры.

Обычно бифункциональные виниловые соединения включают в смесь мономеров для введения сшивающих центров, .Что приводит к тримерной полимерной сетке, Подходящими соединениями являются Н,N -метокси-бис-акриломид и

I этиленгликольдиметакрилат. Если используют эти соединения, полимеризуемая смесь образует нерастворимый гель, который приводят к иммобилизации изомеразы.

Системы инициаторов, которые обычно используют при палимеризации

40 винильных групп могут быть пер1 сульфатом аммония плюс бис тльфат натрия, перекись водорода плюс сульфат железа, сульфат калия плюс

N,N,N,N.-тетраметилэтилендиамин и

45 рибофлавин.

В другом варианте нековалентное присоединение к трехмерной полимерной матрице может быть достаточным для придания нужной жесткости молекуле изомеразы, и тем самым осуществления заметного повышения термостабильности. Это может произойти; если изомеразу механически включают в сшитый полимерный гель. В этом случае нет необходимости в том, чтос5 бы модифицировать изомеразу присоединением к ней. винильных групп перед .стадией полимеризации. Однако, концентрация геля должна быть выше, 15

16

1523056 чем около 30 мас.X перед тем, как произойдет заметная стабилизация и нредпочтительная концентрация геля около 50%. Требуются мономеры, способные образовывать полимерные ге5 ли, которые могут образовывать электростатические и водородные связи с изомеразой, как, например, акрилат натрия, метакрилат натрия, акрил- 10 амид и оксиэтилметакрилат.

Третьим способом отверждения изомеразы является внутримолекулярная сшивка, которая может повысить термостабильность. 15

Нодходяшие сшивающие агенты для иепользовання в изобретении включа" ют бифункциональные соединения, которые способны взаимодействовать с подвешенными функциональными группами молекулы фермента. Чаще всего такими функциональными группами являются аминогруппы, обычно первичные аминогруппы, которые могут взаимодействовать с широким кругом функцио нальных групп, таких как карбоновые кислоты, сульфонилгалиды, альдегиды, изоцианаты, пропиолаты и тому подобные.

Так, сшивающие агенты включают ангидриды дикарбоновых кислот, как янтарный ангидрид, и адипиновый ангидрид, соответствующие диальдегиды такие, как глиоксаль, сукцинальдегид и глутаральдегид, такие ненасыщенные соединения как акролеин и кротональдегид, такие диолпропиолаты, как зтиленгликольбиспропиолат, пропиленгликольбиспрониолат и гексаметиленгликольбис9

49 пропиолат, и дисульфонилгалиды такие как бензол-1,3"дисульфонилхлорид; нафталин-1,5-дисульфонил" .хлорид и толил-2,4-дисульфонилхлорид.

Кроме того, так как фермент содержит или может быть получен так, что содержит кислотные группы, взаимодействующие с аминами, именно бифункциональные амины можно использовать в качестве сшивающих агентов для целей изобретения. Они включают, например, диамины, содержащие вплоть до 12 атомов углерода например фе9

55 нилендиамин, бутилендиамин, гексилендиамин, октилендиамин, пентилендиамин, зтилендиамин и додецилендиамин.

Количество сшивающего агента может существенно изменяться, причем отношение фермента к сшивающему агенту находится в интервале от около

О, 1 до около 0 0001. Способ осущестМ вления нужного связывания в некоторой степени определяется природой выбранного сшивающего агента и ферментом, Вообще, реагенты нужно растворять в подходящем инертном растворителе и реакцвю следует вести нри достаточно низких температурах, чтобы избежать вредных воздействий на фермент, который .может быть чувствительным к высоким температурам.

Обычна, предпочтительна реакция при комнатной температуре или. около нее, а в качестве реакционной среды используют воду или водные растворителие

Кроме замещения полимеризуемых винильных групп на молекуле фермента и последующей полимеризации в соответствии с описанными ранее спо-. собами дальнейший вариант включает конденсацию предварительно получен" ного полимера с изомеразой путем образования внутримолекулярных ковалентных связей для получения стабилизированной молекулы. Так, например, полипептиды, такие, как встречающиеся в природе протеины и продукты их гидролиза, можно подвергнуть взаимодействию, используя известные методики для создания пентидной связи с глюкоизомеразой до получения стабилизированного фермен- . та. Полученные таким образом продукты могут быть водорастворимыми, но им можно придать свойство не растворяться в воде, используя такие смешивающие агенты, как глутаральдегид, и обычно полученная сшитая фер" ментная система еще более стабильна.

При желании исходный фермент можно преобразовать, включив нужную функциональную группу в молекулу в целях конденсации с ранее полученной молекулой. Так, для введения карбоксильной функциональной группы фермент, содержащии свободную аминоrруппу, следует подвергнуть взаимодействию с дикарбоновой кислотой для превращения в фермент, содержащий карбоксильную группу.

Предварительно полученными полимерами, которые следует использовать в описанном ранее варианте, могут

17, 1523056

18 быть любые, которые содержат нужныи тип и количество функциональных групп, например аминогрупп или карбоксильных групп для проведения нуж5 нон реакции. Предпочтительными являются полипептиды, такие как природные протеины, например хитозан, дрожжевой протеин и тому подобные, так.же как и смеси; и полимеры, содержащие аминогруппы, такие как полиэтиленимин. Обычно предпочтительные предварительно полученные полимеры образуют водорастворимые продукты и предпочтительно придать им не- 15 растворимость за счет взаимодействия со сшивающими агентами, например глутаральдегидом и другими описанными ранее соединениями.

Во всех описанных способах модификации ферментов существенным является условие, чтобы достаточное количество функциональных групп, например аминогрупп или карбоксильных групп, имелось в наличии для дости- 25 жения заметного уровня искомого результата.

Так, например, при выборе предварительчо полученного полимера, который должен взаимодействовать с ферментом, требуется, чтобы полимер содержал группы, которые реагировать с доступными группами молекулы фермента. Так, протеин с подвешенными карбоксильными группами следует выбирать для взаимодействия с подвешенными аминогруппами фермента. Кроме того, должно существовать разумное количество реакционноспособных групп у выбранного реагента, чтобы обеспечить множество точек присое40 динения реагентов для достижения существенной стабилизации.

Еще один способ,- с помощью которого можно повысить термостабильность фермента, состоит в химическом изме45 кении структуры поверхности без заметных потерь активности. Так, поверхностные аминогруппы можно ами дировать или гуанидировать до получения заместителей, сильно напоминающих аргинин, Лактикдегидрогеназа и некоторые другие протеины были стабилизированы. Один IGIU является количеством изомеразы, которое превращает 1микромоль глюкоэыво фруктозу в течение 1мин в растворе, содержащем 2 моль глюкозы на ) л, 0,02 моль MgSO на 1 ли 0,001 моль

CoClz íà 1 л при рН 6,85 (0,2 М малеат натрия) и при температуре 60оС при определении вышеуказанным способом.

Пример 1. Демонстрирует прямую изомеризацию глюкозы при высоких температурах до достижения композиции, содержащей 55,5Х фрук" тоэы в расчете на сухую массу, при использовании двухстадийной системы изомеризации.

Растворимую глюкозоизомераэу получают по способу, аналогичному способу, описанному в патенте США

11- 3788945.

Внц Streptomyces гиЬ депоэиэ, полученный из S. rubigenosus АТСС

21175, выращивают подводной аэробной ферментацией íà среде следующего состава, мас.Я:

Декстроза 9,0

Сироп замоченной кукурузы (твердая часть) 1,6

Диаммойийфосфат 0,08

Сульфат марганца 0 06

Противовспенивающий агент (Плуро:ник РЕ-61) 0,003

Указанную среду стерилизуют при

121 С в течение 45 мин, охлаждают и. устанавливают рН 6,8-7,0. Fe инокулируют 14 об.7 инокулюмом, содержащим затравочный ферментер, полученный с помощью S. rubigenosus варианта, указанного выше. Ферментацию проводят в асептичс ских условиях о при 30 С в течение около 60 ч при аэрации. S. rubigenosus ATCC 21175 можно также использовать для инокулирования и получения изомераэы.

В этом случае используют среду следующего состава, мас.й:

Декстроэа 0,24

Сироп замоченной кукурузы (твердая часть) 1,5

Сорбитол 1,6

CoCl 0,02

Диаммонийфосфат 0,56

Ксилоза 1,0

Глюкозоизомеразу экстрагируют из

$. rubigenosus. Затем полученный экстракт фильтруют до получения раствора сырой неочищенной глюкозоизомеразы.

Неочищенную глюкозоизомеразу очищают адсорбцией на ДЕАЕ-целлюлозе, 1523056 фильтрованием и промывкой адсорбированного продукта, 9,1 М NaCl раствором для удаления примесей, а затем, десорбируя путем контактнрования с

0,45 М раствором ИаС1 рН всех растворов поддерживают при 7,5 во время стадий очистки. Раствор частично очищенной изомеразы, полученный при этом, смешивают с 3 объемами

95% этанола при О C до осаждения о изомеразы. Добавляют перлитный фильтр, твердую часть выделяют фильтрованием и сушат воздухом до получения растворимого препарата изомеразы, содержащего 2500 IGIU/ã.

Удельная активность препарата изомеразы составляет 40 ХСХц/мг протеина.

Низкотемпературный (70 С) реактор изомерации приготавливают, набивая иМмобилизованную изомеразу,, подготовленную по способу патента

США N- 3788945, встеклянную колонку диаметром до 2,54 см до получения, слоя 5 см по высоте, содержащего

20000 ТСТАВ .активности. Б .верхнем пространстве над слоем насадки устанавливают термометр и располагают стеклянные шарики для сведения к минимуму мертвого обЪема, насколько это возможно. Колонка имеет впускное и выпускное отверстие и окружена рубашкой для циркуляции воды из термостата.

Высокотемпературный реактор (93 С) подготавливают таким:же образом, используя иммобилизованную изомеразу, полученную адсорбцией очищенной изомеразы.на ДЕАК"целлюлозе.

Слой насадки содержит 97000 lGIU и имеет высоту 15 см.

Один 1GIU представляет собой количество изомеразы, которое превращает 1 мкмоль глюкозы во фруктозу за 1 мин в растворе, содержащем

2 моль глюкозы на 1 л, 0,02 ммоль

NgH0 íà 1 л и 0,001 моль ÑîÑ1 на

1 л при рН 6„85 (0,2 М малеата нато рия) и при температуре 60 С.

Раствор, содержащий глюкозу, подготавливают, растворяя кристаллическую глюкозу в деминерализованной воде до получения раствора, содержащего 48% сухого вещества nî ìaññå.

Активирующий и стабилизирующий агенты растворяют в растворе глюкозы до получения 25 мМ натрийметабисульфита, 5 мМ сульфата магния и 0,1 мМ хлористого кобальта. рН раствора устанавливают 6,8 гидроокисью натрия.

Первую стадию низкотемпературной о изомеризации проводят при 70 С, прокачивая вышеуказанный раствор глюкозы через низкотемпературный реактор со скоростью 3,7 мл/мин. Первые

2500 мл раствора, поступающего из реактора, сливают, а поток» поступающий из реактора после этого, собирают для использования на второй высокотемпературной стадии. При высокотемпературной изомеризации раствор, полученный при изомеризации при 70 С, прокачивают через высокотемпературный реактор, подготовленный, как описано вьппе, со скоростью 5 мл/мин, поддерживая темпео ратуру в реакторе 93 С. Время контактирования раствора в высокотемпературном реакторе с иммобилизованным ферментом составляет около 12 мин. о

Полное время„ в течение которого раствор находится при температуре о

93 С внутри реактора, составляет около 18 мин. Полученный раствор охлаждают в ледяной бане немедленно после того, как он поступает из высокотемпературного реактора и рН его усганавливают 4,0. Поток, вытекающии из высокотемпературного реактора в течение первого часа сливают.

Изомеризованный раствор глюкозы,. полученный из реакторов, работающих при 70. и 93 С, анализируют на содержание. углеводов и окраску, полученные результаты сравнивают с аналогичными результатами, полученными для неизомеризованного раствора глюкозы, как показано в табл. 1.

Полученные результаты показывают, что содержание фруктозы 55,5% можно достичь при содержании псикозы менее 0,5 мас ° %. Окраска — менее, чем 5 (CIRF к 100).

Содержание углеводов определяют по.сноссбу Е-61, а окраску по способу F-14, стандартных аналитических методов МешЪег companies of the Cornf

Befiners Association, Corn Hefiners

Association, Inc., 1001 Connecticut

А пеппе,Ыаshington, D. Ñ. 20036.

Значения окраски, полученные по способу F-14, умножают на 100 и приводят в виде (СТЕР х 100).

Н р и и е р 2. Иллюстрирует получение содержащего фруктозу продукта с содержанием фруктозы 55,2%, 21

22

1523056 полученного из глюкоэосодержащего раствора, состоящего, главным образом, из очищенного гидролизата кукурузного крахмала.

Гидролизат получают из кукурузного крахмала по способу, описанному в патенте США 9 3644126 (ожижение) и патенту CIHA 11 3280006 (осахаривание), Осахаренкый сироп очищают по способу патента СШЛ

У 3834940 до получения продукта, содержащего 95,3% глюкозы в расчете на сухую массу и 50% полного содержания твердой части. Добавляют достаточное количество кристаллической глюкозы для доведения полного содержания глюкозы до 87,1% в расчете

На сухую массу. Полученный таким образом раствор имеет следующии сосг тав:

Полное содержание сухого вещества, % 42,4

Глюкоза, % в расчете на сухую массу

Фруктоза, % в расчете на сухую массу 0,1

Полисахарид, % в расчете на сухую массу 2,8

Псикоэа, % в расчете на сухую массу 0,0

NaHS0, мМ 50,0

М8ЯО, и 5,0

СоС1,, мМ 0,1

РН 6,8

Высокотемпературный реактор подготавливают, как описано в примере 1, он содержит 147500 IGIU в слое 16 5 см высоты. Температуру поддерживают 97,4 С. Вышеуказанный раствор прокачивают через слой насадки со скоростью 4,4 мл/мин. Первые 50 мл потока, вытекающего из реактора, сливают, а поступающий из реактора после этого поток отбирают на анализ. Полученные результаты представлены ниже в сравнении с составом неизомеризованного раствора глюкозы (табл. 2).

Полученные результаты показывают, что можно получить уровень фруктозы более 55% при образовании лишь 0,2% псикозы. Более сильное окрашивание продукта в этом примере связано с тем, что всю кзомеризацию проводят при высокой температуре (97,4 С) в противоположность двухстадийкому способу примера 1, где большая часть фруктозы была об"

97,6

0,0 разовака при более низкой температуре (т.е. при 70 С), к окрашивания удалось избежать, благодаря использованию двухстадийкого реактора. Тем ке менее, окрашивание составило величину менее 13 (CIPiF x 100).

П р и и е р 3, Демонстрирует получение продукта с содержанием фруктозы 55,3%. в расчете ка сухую массу из глюкозосодержащего раствора, состоящего из очищенного гпдролиэата кукурузного крахмала плюс кристаллическая глюкоза, при использовании двухстадийной системы изомеризапричем ка в opcй стадии используют коммерчески доступную иммобилизовакную глюкоэоизомераэу.

Растворимую глюкоэоизомеразу для реактора первой стадии получают и очищают по способу, описанному в примере 1. Удельная активность это- го препарата составляет 40,9 IGIU/мг протеина. Всего 25000 ТОП! этого фермента иммобилизуют, адсорбируя на 10 г Ватман ДЕ-23 ДЕАЕ-целлюлозе.

Этот иммобилиэованкый фермент использун>т для приготовления реактора на

0, 70 С в стеклянной колонке диаметром

30 2,54 см с рубашкой, как описано в примере 1. Высота слоя насадки составляет 13 см, Субстрат для этого реактора подготавливают точно так же., как и в прииере 2, и ок имеет следующий состав:

Полное содержание сухого вещества, % 50,2

Глюкоза, % в ра"чете на сухую массу

Фруктоза, % в расчете ка сухую массу

Полисахарид, % в расчете на сухую массу 2,4

Псикоза 0,0

8ahS0ý, мМ 50,0

МдЯО, М 5,0

СоС1 0,1 рН 6,8

Низкотемпературную изомеризацию проводят при 70 С, прокачивая вышеуказанный раствор субстрата через низкотемпературный реактор со скоростью потока 3,2 мл/мин. Первые 1000 мл, 55 коступаюших из реактора сливают. Поток же, поступающий после этого собирают для использов":íèÿ ка второй стадии высокотемпературной кзомериэации.

1523056

Фермент,. который используют для получения высокотемпературного.реактора, является коммерчески доступной иммобилиэованной изомеразой.

Этот фермент, Naxazyme GI иммобилиэованный, партия К-12467, вначале измельчают в ступке для уменьшения размера частиц. Затем измельченный фермент пропускают сквозь стандартное сито 20 мешей, а ту часть, которая. удерживается ситом

60 мешей, суспендируют в субстрат и деаэрируют в условиях лабораторно. го вакуума при 60 С в течение 60 мин.

Затем деаэрированную суспензию используют для приготовления слоя насадки 1,5 х39 см в стеклянной колонке с рубашкой. Слой насадки содержит

5200 IGIU.

Субстрат, полученный на первой о стадии 70 С изомеризации, доводят, p,o рН 6,5 и разбавляют до содержания сухой части 42,6Х. Затем полученный субстрат прокачивают через колонку со скоростью потока 5 мл/мин при 60 С в течение 30 мин. Температуру внутри колонки контролируют термометром, расположенным непосредственно над слоем насадки и окруженным стеклянными шариками

0,5 м ч диаметром для сведения к минимуму мертвого объема, насколько это возможно, Затем температуру колонки быстро повышают за счет циркуляции воды из термостатированной при 97,8 С бани через рубашку. Когда температура колонки досо тигает 97 С, скорость потока субстрата снижают до 2,0 мл/мин. При этой скорости потока время контак- ., тирования субстрата с иммобилизованным ферментом составляет около

22 мин, а полное время пребывания о раствора внутри реактора при 97 С составляет около 35 мин.

Поток, вытекаюший из колонки, контролируют записываюшим поляриметром, откалиброванным на значения уровня фруктозы от 50 до 58%. Когда содержание фруктозы в вытекаюшем из колонки потоке достигает нужного уровня, этот вытекаюший поток собирают и охлаждают немедленно в ле. дяной бане. рН устанавливают 4,0, добавляя 1 И лимонную кислоту. Вытекающий поток собирают до тех пор, пока содержание фруктозы не падает ниже 55%.

Глюкозоиэомераэу экстрагируют из

45 г клеточной массы, суспендируя

45 клетки в 25 мл воды, содержащей

900 мг лиэоцима куриного яйца и

250 мг сухих шариков поверхностноактивного ВТС-835 (Оникс Кемикал

Ко), устанавливая рН 7,0, инкубируют 16 ч при 45 С. Затем полученную о суспензию центрифугируют и собирают надосадочную жидкость. Нерастворимый материал IIQBTopho суспеHpируют в 250 мл 0,1% Тритон Х-100 (Сигма Кемикал Ko), pH 7,0 и инкуо бируют в течение 8 ч при 45 С. Эту суспензию центрифугируют, и надосадочную жидкость обьединяют с жидкоИзомериэованные растворы, полученные из реакторов при 70 и 97 C., анализируют на содержание углеводов.и окраску, полученные результаты сравнивают с аналогичными результатами, полученными для раствора неизомеризованного субстрата, как показано в табл. 3.

10 Полученные результаты показывают, что уровень фруктозы 55,3Х можно достичь, сохраняя содержание псикозы менее 0,4 мас.Х в расчете на сухую массу.

Пример 4. Демонстрирует прямую изомеризацию глюкозы при высокой температуре до получения композиции, содержашей 55,8% фруктозы, при условии, что вторую стадию изомеризации проводят на иммобилизованной иэомеразе, полученной из вида Arthrqbacter.

Штамм Arthrobacter citreus выращивают в условиях подводной аэробяой ферментации на среде следуюшего сос25 тава, мас.%:

Ксилоэа 1,5

BHI (мозговая питательная среда) 4,2

Дрожжевой экстракт 0,1

Хлористый натрий 0,2

Казеиновая аминокислота 0,5

Сульфат магния 0.024 рН 6,9-7,2

Ферментацию проводят в асептических условиях при 30 С в течение

44 ч. Клеточную массу собирают центрифугированием промывают 0,85Х-ным хлористым натрием и снова центрифугируют. При этом получают 76 r кле — точной массы при полной активности изомеразы 10260 IGIU.

46,9

0,8

0,0

50,0

5,0

0,1

6,7

Этот субстрат прокачивают через реактор при 60 С в течение 30 мин со. скоростья потока 6 мл/мин. Затем температуру колонки быстро повьппают до 97,8 G, скорость потока снио жают до "2 мл/мин и вытекающий поток контролируют, как в предыдущем примере. Вытекающий поток собирают в ледяную баня и устанавливают рН

4,0 1 M лимонной кислотой.

25 1 стью, полученной при первом центрифугировании.

Объединенные экстракты концентрируют и очищают ультрафильтрацией с Амикон 401 ячейкой с перемешиванием, используя мембрану УМ-30, Остаток дважды фильтруют с двумя

5-кратными объемами 0,2 мм СоС1

1 мМ МАМБО раствором при рН 7,0.

Конечный остаток после ультрафильтрации содержит всего 3115 IGIU.

Этот фермент используют для получения иммобилизованной изомераэы путем адсорбции на ДЕАЕ-целлюлозе по способу патента США 3788945. К раствору добавляют всего 4,0 г Ватман ДЕ-23, рН устанавливают 7,0 и полученную суспензию перемешивают в течение 60 мин при комнатной температуре.

Полученный нерастворимый фермент собирают фильтрованием, промывают водой. Часть промытого иммобилизованного фермента суспендиру ют в субстрате, деаэрируют при 60 С в течение 60 мин и используют для приготовления слоя насадки 1,5» х13 см в высокотемпературном реакторе.

Субстрат для реактора приготавливают по способу примера 1 на первой стадии (70 С) изомеризации.

Этот субстрат имеет следующий состав:

Полное содержание сухого вещества, Х 42, 6

Глюкоза, Х в расчете на сухую массу

Фруктоза, Х в расчете на сухую массу 52,3

Полисахарид, Х в расчете на сухую массу

Псикоза

NaHS0, мМ

MgSO„m

СсС1, мМ рН

523056

Поток, вытекающий из реактора о

97,8 С, субстрат, полученный на первой стадии (70 С) изомеризации и исходный раствор декстроэы, который используют в качестве субстрата для реактора, работающего при 70 С, анализируют на содержание углеводов и окраску.

Полученные результаты приведены в табл. 4.

Полученные результаты показывают, что можно получить 55,8Х фруктозы при сохранении уровня псикоэы ниже 0,2Х, а окраску ниже 6 (CIRF х100).

П р е р 5. Демонстрирует применение двухстадийной системы изомеризации, в которой реактор второй стадии используют при температуре выше 100 С для получения продукта с содержанием фруктозы 55,5Х

Субстрат для реактора второй стадии получают в реакторе первой стадии точно так, как описано в приме25 ре 3, и рН устанавливают 6,6.

Иммобилизованная изомераза для реактора второй стадии представляет собой изомеразу Махакутпе. GI (иммобилиэованная), которую измельчают и просеивают, как описано в примере 3. Полученный фермент суспендируют в субстрате, деаэрируют при

60 С и используют для получения

1,5х40,5 см слоя насадки в высоко35 .температурном реакторе. Полная активность изомеразы составляет

5820.IGIU. Субстрат прокачивают через реактор при скорости потока

6 мл/мин всего в течение 60 мин.

40 Затем "емпературу колонки повышают о до 102 С, скорость потока субстрата снижают до 3 мл/мин.

В этих условиях время контактирования субстрата со слоем фермента составляет около 16 мин„ а полное время пребывания при 102 С составляет около 24 мин.

Поток, вытекающий из колонки, собирают и анализируют, как описано в примерах 3 и 4. Полученные результаты приведены в табл. 5.

Получают продукт, который при соедержании фруктозы 55,5Х, содержит только 0,2Х псикозы.

Пример 6. Демонстрирует непосредственную изомерацию глюкозосодержащего раствора, состоящего преимущественно из очищенного гидролизата кукурузного крахмала, с полу1523056

О,О чением композиции с содержанием

55,5 мас.% фруктозы в расчете на сухую массу, если используют двухстадийный процесс изомеризации. Вначале проводят изомеризацию при низкой температуре (70 С) и продукт этой реакции используют в качестве сырья во втором высокотеиттературном реакторе (105,2 С), содержащем хими" чески стабилизированную изомеразу.

Химически стабилизированная изомераэа является изомеразой9 в которой фермент ковалентно связан с растворимым полимером, а затем превращен

s нерастворимый для получения иммобилизованного катализатора.

Гицролизат получают из кукурузного крахмала по способу, описанному в патенте США М- 3644126 (ожижение) и Р 3280006 (осаживание). Осахаренный сироп очищают по способу патента США 119 3834940 до получения продукта9 содержащего 95,3% глюкозы . в расчете «а сухую массу. Добавляют достаточное количество кристал- лической глюкозы для доведения полного содержания глюкозы до 97,6% в расчете на сухую массу. Полученный раствор имеет следующий состав:

Вещества сухого всего, % 50,2

Глюкоза, % в расчете на сухую массу 97,6

Фруктоза, % в расчете на сухую массу

Полисахариды, % в расчете на сухую массу 2,4

Псикоза, %. в расчете на сухую массу 0,О

NaHSO>9 мМ 50,0

МАЗО, 5,0

СоС1, мМ 0„1 рН 6,8

Ниэкотемпературную изомериэацию проводят при 70 С„ прокачивая раствор вышеуказанного субстрата через иизкотемпературный реактор со скоростью потока 3,2 мл/мин. Низкотемпературный реактор (70 С) изомеразы выполнен путем уплотнения изомеразы, иммобипизованной.на ДЕЛЕцеллюлозе в стеклянную колонку диаметром 2,54 см, снабженную входным и выходным отверстиями с рубашкой для циркуляции воды из термостата.

В верхней части под насадкой имеется термометр, а остальное пространство заполняется стеклянными

1,6

0 08

0,06

0,003

Указанную среду стерилизуют при

121 С в течение 45 мин, охлаждают и устанавливают рН 6,8-7,0. Среду инокулируют 14% {мас./мас.) инокулюма, содержащего затравочный фермент, полученный из S. rubigenosus. Ферментацию ведут в асептических условиях о при 30 С в течение около 60 ч при аэрации 0,65 vs (процентное соотно= шение объемов в минуту). Для иноку40 лирования и получения изомеразы можно также использовать S. rubigenosus

АТСС "-1175, но в этом случае исполь" зуют среду следующего состаца9 мас.%:

Декстроза 0,24

Сироп замоченной кукурузы (твердая часть) 195

Сорбитол 1,6

Хлорид кобальта 0,02

Диаммонийфосфат 0,56

Ксилоза 1,0

Глюкозоизомеразу экстрагируют из S. rubigenosus, добавляя 0,35%

Maguat MC1412 (Мейсон Кемикал Ко.) и 10 ч. на млн лизоцима куриного яйца, и перемешивая в течение 5 ч при 40 С, рН 6,3-6,6. Затеи получен" ную смесь фильтруют до получения раствора сырой неочищенной глюкозоизомеразы. шариками для снижения мертвого пространства насколько это возможно. Реактор содержит достаточное количество изомеразы для обеспечения

20000 IGIU и слой насадки имеет высоту около 15 см. Первые 1000 мл, поступающие из реактора, сливают.

Вытекающую после этого жидкость собирают для использования на второй стадии высокотемпературной изомеризации.

Химически стабилизированный катализатор, который используют в высокотемпературном реакторе, получают следующим образом, Вид Streytomyces rubigenosus„ полученный из S. rubigenosus ЛТСС 21175, выращивают подводной аэробной ферментацией на среде следующего состава, мас.%.:

Декстроза 9,0

Сироп замоченной кукурузы (твердая часть)

26 Диаммонийфосфат

Сульйат марганца

Антивспенивающий агент (Плуроник Р-61) 29

Неочищенную иэомеразу очищают адсорбцией на ДЕАЕ-целлюлозе с последующей фильтрацией и промывкой адсорбированного продукта 0,1 M раствором NaCl для удаления примесей, а затеи десорбируют изомеразу, подвергая ее контактированию с 0,45 М раствором NaCl. рН всех растворов поддерживают 7 5 на всех стадиях очистки. Раствор частично очищенной изомеразы, полученный при этом, смешивают с 3 объемами 95Х-ного этанола о при 0 С для осаждения изомеразы.

Твердую часть выделяют фильтрованием и сушат воздухом до получения растворимога препарата изомеразы, содер.жащего 2500 ХОПА/г.

0чищенную изомеразу растворяют в

1.мМ МпС1 до получения раствора, содержащего 10 мг изомеразы на 1 мл, при комнатной температуре и получен.ную смесь фильтруют для удаления фильтра.

Удельная активность этого препарата составляет 37,3 IGIU/ìã протеина.

Раствор растворимого полиаминноrо полимера получают, растворяя

39,0 г хитозана в 13 л 0-,08 í. HCl;

После растворения раствор хитозана доводят до 0,5 И в NaCl, добавляя

380 г ИаС1, и рН полученного раствора устанавливают 6,15 8 í. NaOH.

Хитозановый раствор фильтруют че-. рез фильтр бумаги Ватман =,Ф 3 для удаления нерастворимого материала.

: К 13 л 0,3Х хитозана в 0,5 M ИаС1 при рН 6,15 добавляют 200 мл растворимой изомеразы, содержащей

100000 IGIU активности, 197,6 г ксилитола и 0,619 г СоС1 6Н О.

Полученный раствор перемешивают в течение 2 ч, после чего 6;24 r 1-этил3-диаметиламинопропилкарбодиимида добавляют для ковалентного связывания во множестве точек карбокснльных групп изомеразы с аминогруппами хитозана. Спустя 2 ч при комнаткой температуре 15,6 мл 50%-ного глутаральдегидного раствора устанавливают. рН 6,0 с помощью 8 í. NaOH u добавляют в реакцию для придания нерастворимости ковалентносвязанному комплексу изомераза-хитозан. Спустя

15 мин 2 л 1 М фосфатного раствора при рН 8,0 добавляют для облегчения разделения геля после того, как он образовался, при добавлении глутар60

1523056 30 альдегида. Полученный нера створимыи изомераза-хитозан промывают деиони1 зированной водой на вакуумном фильтре Бюхнера. Полученный препарат

5 далее сушат на воздухе в течение ночи при комнатной температуре, затем .измельчают и просеивают сквозь сито

12-60 мешей. Сухой катализатор обладает выраженной активностью 384 IGIU/r

Порцию катализатора (13 r) суспендируют в субстрате и деаэрируют в условиях лабораторного вакуума при комнатной температуре в течение 60 мин.

Суспензию, в которой удален воздух, используют для подготовки слоя 1,5»

»20 см насадки в стеклянной колонке с рубашкой. Слой насадки содержит

4992 IGIU.

Субстрат, полученный на первой

2 о стадии при 70 С изомеризгции, дово,дят до рН .6,5, и разбавляют до содержания сухого вещества 42,0%. Затем этот субстрат прокачивают че2б рез колонку высокотемпературного реактора под давлением при скорости потока. 1,96 мл/мин при 60 С в течение 30 мин. Температуру в колонке контролчруют термометром, расположенным.непосредственно над слоем и окруженным 0,5 см стеклянными шариками для минимизации мертвого объема, насколько это возможно. Затем температуру колонки быстро повышают за счет циркулирующего через рубашку масла из термостатированной при

106 С бани.

Вытекающий из колонки поток контролируют на полярычетре, откалиброванном на значении от 50 до 58% фруктозы, После того, как температура в колонке достигает 105,2 С, и когда содержание фруктозы в вытекающем потоке достигнет нужного уровня, вытекающий ноток отбирают и немедленно

45 охлаждают в ледяной бане. рН устанавливают 4,9, добавляя 1 M лимонную кислоту. Вытекающий поток собирают до тех пор, пока относительный уровень фруктозы не падает ниже 55Х.

Изомеризованные растворы, полученные из реакторов 70 и 105,2 С, -анализируют на содержание углеводов и окраску, полученные результаты сравнивают с аналогичными данными для неизомеризованного раствора субстрата (табл. 6).

Полученные результаты показываfoT» что 55,5%. фруктозы достигают

1523056

32 при содержании псикозы менее

0,5 мас.Ж в расчете на сухую массу, а окраска менее 20 (СП Гх100).

Пример 7. Демонстрирует прямую иэомеризацию раствора, содержащего глюкозу (состоящего из очищенного гидрализата кукурузного крах мала плюс. кристаллическая глюкоза), при высоких температурах для достижения состава, содержащего 55,2% фруктозы в расчете на сухую массу, в случае, когда используют двухстадифную изомеризацию, причем на вто. рой стадии используют химически стабилизированную изомеразу, состоящую из глюкозоизомеразы, закомплексованной с полиэтиленимином, причем этот комплекс превращен в нерастворимый за счет обработки глутаральдегидом.

Получение стабилизированной изомеразы.

Растворимая глюкозоизомераза была получена, как описано в примере

1. Очищенную изомеразу растворяют в .1 мМ МцС1 до получения раствора, содержащего 9 мг изомеразы на 1 мл, при комнатной температуре и полученную смесь отфильтровывают для удаления фильтра. 60 мл 10% мас./объем (PEI-6).полиэтиленимин МВ 600, рН 8, и 3 г ксилитола добавляют к

300 мл раствора фермента, полученный раствор перемешивают в течение

15 мин, 10 мл 2,5 М глутаральдегида добавляют, и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Нерастворимый фермент выделяют фильтрованием, промывают водой и сушат в течение ночи при

37 С. 12,8 г иммобилизованной изомеразы, содержащей около 775 ХОТУ/г, выделяют после сушки. 12 г иммобилизованного фермента суспендируют в субстрате, деаэрированном в вакууме, в течение 60 мин при комнатной температуре и используют в высокотемпературном реакторе с диаметром

1,5 см.

Субстрат для этого реактора получают на первой из двух стадий изо" меризации, как описано в примере 1.

Состав субстрата следующий:

Полное содержание сухого вещества, % 42,6

Глюкоза, % в расчете на сухую массу 46,4

Фруктоза, % в расчете на сухую массу 5l,3

Полисахарид, % в расчете на сухую массу .2,3

Псикоза, % в расчете на сухую массу 0,0

NaFIS0q мИ О

X@SO, И . 50

СоС1, мИ 0,1 рН 6,75

10 Субстрат прокачивают через реако тор при 60 С в течение 45 мин со скоростью около 5 мл/мин. Затем темо пературу колонки повышают до 101,6 С, а скорость потока снижают до

2 мл/мин. Вытекающую жидкость контролируют записывающим поляриметром, откалиброванным на значения от 50 до 58% фруктозы. Вытекающий поток, в котором содержание фруктозы пре2р вышает 55%,собирают в ледяную баню и устанавливают рН 4,0 с помощью

1,0 М лимонной кислоты.

Поток, поступающий из высокотем1 пературного реактора, субстрат из

25 реактора первой стадии и исходный .содержащий глюкозу раствор, который ! используют в качестве субстрата для ,первой стадии реактора, проанализировали на содержание углеводов в

30 композиции и на окраску. Полученные результаты приведены в табл. 7.

Полученные результаты.показывают, что достигают уровня фруктозы

55,2%, поддерживая уровень псикозы ниже 0,2 мас.X в расчете на сухую массу.

П р и и е р 8. Демонстрирует прямую изомеризацию глюкозы до 57,2% фруктозы путем двухстадийной изомеризации, в которой первый реактор работает прн 70 С, а второй (высокотемпературньй) реактор функционирует при 110,4 С. Химически стабилизированная изомераза, которую используют в высокотемпературной реакции, является изомеразой, в которой фермент ковалентно связан с растворимым полимером, а затем полимер превращен в нерастворимьй для получения тщмобилизованного катализатора.

Субстрат и его конверсия в реакторе первой стадии при 70 С были описаны в примере 1.

Иммобилизованный катализатор, которьй используют в высокотемпературо ном реакторе при 110,4 С, также был описан в примере 1. о

Реактор на 110,4 С подготавливают следующим образом. Порцию ката33 лизатора 28,4 г суспендируют в субстрате и деаэрируют в условиях лабораторного вакуума при комнатчой температуре в течение 60 мин. Деаэрированную суспенэкю используют для получения слоя насадки 2,5»

4 12,4 см в стеклянной колонке с рубашкой. Слой насадки содержит

10,885 IGIU.

Субстрат, полученный на первой о стадии (70 С) изомеризации, доводят до рН 6,47 и разбавляют до 42,0% сухого вещества. Затем полученный субстрат прокачивают через колонку высокотемпературного реактора под давлением и при скорости потока

3,38 мл/мин при .температуре 60 С в течение 30 мин. Температуру в колонке контролируют с помощью термометра, расположенного непосредственно над слоем и окруженного 0,3 см стеклянными шариками для минимизации мертвого объема, насколько это возможно. Затем температуру колонки быстро повышают за счет циркуляции через рубашку масла из термостатируемой при 111 С бани.

Поток вытека»>шкй из колонки контролируют с помощ;>K) записывающего поляриметра, откалиброванного на значения уровня фруктозы от 50 до

" S8 . После того, как температура. ко лонки достигает 110,4 С и когда содержание фруктозы в вытекающем потоке достигает нужного уровня, вы" текающик продукт собирают и немедленно охлаждают на ледяной бане. . Значение рН устанавливают 4,0, добавляя 1 M лимонную кислоту.

Изомеризованные растворы, получейные из реакторов 70 и 110,4 Ñ, анализируют на содержание углеводов и окраску, полученные результаты сравнивают с результатами анализов, проведенных для раствора неизомеризованногс субстрата (табл. 8).

Полученные результаты показывают, что 57,2% фруктозы достигают при содержании псикозы ниже 0 4 мас. в расчете на сухую массу, а окраска (CIBFx100) ниже 20.

Пример 9. Демонстрирует пря мую изомеризацию содержащего глюкозу раствора, содержащего очищенный гидролизат кукурузного крахмала для получения композиции 56,3 . фруктозы в расчете на сухую массу, если используют двухстадийный процесс изо1523056 34

55 меризации. Вначале проводят низкоо температурную изсмеризацию при 70 С, продукт, полученный на этой стадии, используют в качестве сырья на второй высокотемпературной стадии в о реакторе с температурой 103,3 С, содержащем химически стабилизированную изомеразу. Химически стабили зированная изомераза представляет собой изомеразу, в которой фермент подвергнут совместной реакции с защитным нротеинсм (таким, какой получают из дрожжей).

Низкотемпературная стадия изомеризяции, включая описание субстрата и экспериментальные условия, представлена в примере 1.

Химически стабилизированный фермент глюкозскзомераза, использованный в высокотемпературном реакторе, получают следующим образом. Растворимую глюксзоизомеразу для химической стабилизации получают и очищают по способу, описанном в примере 1. Удельная активность этого препарата составляет около 40 IGIU/ìã протеина. Защитный протеин .получают из пекарских дрожжей следующим образом. К 1229 г влажных лекарских дрож-. жей добавляют 1000 г воды и 500 r толуола. Пслученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение около 30 мин. Полученную смесь фильтруют на воронке Бюхнера. Почти весь толуол остается с нераствори" мыми осколками клеток, тогда как водный экстракт содержит растворимый экстракт дрожжей. Водный фильтрат упаривают, до объема 276 г (роторный испаритель, 40 С), затем при перемешиваник добавляют 41 r трифторуксусной кислоты. Осажденный дрожжевой протеин собирают, затем повторно растворяют в 0,1 М натрийфосфатном буфере (pH 7,0). После осветления фильтрованием полученный раствор

Обрабатывают 900 .мл (около 3 объемов) ацетона, Осадок собирают, растворяют в 0,01 И натрийфосфатном буфере (рН 7,0), а оставшийся раствор диализуют против 0,01 М натрийфосфатнсго буозера. Полученный продукт (150 мл) считают защитным протеином, полученным из пекарских дрожжей.

0,6%-ный раствор хитозана получают, растворяя 24 r хитозана в 4 л

0 08 н. НС1. рН раствора устанавливают 6,2 8 H. NaOH, фильтруют че23056 36

35 15 рез фильтровальную бумагу Ватман ф3, проводят диализ против 1& л деионизированной воды. В химический стакан объемом 400 мл помещают около

100000 1GIU растворимой глюкозоизомеразы-фермента (в смеси с фильтром), 1 г ксилитола и 100 мл (2/3) защищенного протеина, полученного из пекарских дрожжей. К этой смеси добавляют 2,4 мг Ng80 7Н О и 24 мкл молярного раствора хлористого кобальта. Полученную смесь фильтруют для удаления фильтра, а затем раствор концентрируют (роторный испаритель, 40оС) почти досуха в двухлитровой круглодонной колбе. Затем в эту колбу добавляют 800 мл хитозана (рН 6,2). Полученную смесь концентрируют почти досуха и добавляют

640 мкл 50 -ного раствора глутаральдегнда .(рН устанавливают 6,5).

Полученную смесь хранят в холодной комнате в течение ночи. Затем гель удаляют из колбы и продавливают сквозь сито 30 мешей, сушат в сушильном шкафу примерно при 37 С.

Высушенный препарат фермента просеивают для удаления мелких частиц, а затем используют (8,9 г конечного продукта) для иэомеризации в высоко- . температурном реакторе. о

Реактор для работы при 103,3 С подготавливают следующим образом.

Полученную ранее глюкозоизомеразу (8,9 г) суспендируют в субстрате и деаэрируют в условиях лабораторного вакуума при комнатной температуре в течение окало 30 мин. Деаэрированную суспенэию используют для приготовления слоя насадки 1,5

« 29 см в стеклянной колонке с рубашкой. Субстрат, полученный на первой стадии изомерации при 70"С, доводят до рН 6,75 и разбавляют до содержания 42,67 сухого вещества, Затем пол /ченный субстрат прокачивают через высокотемпературную колонку со скоростью потока около 1,5 мл/мин при температуре 600 С в течение 30 мин.

Температуру внутри колонки констролируют термометром, расположенным непосредственно над слоем и окру" женным стеклянными шариками (0,5 см диаметром) для минимизации мертвого объема. Температуру колонки резко повышают эа счет циркуляции через рубашку колонки масла из термостао тированной при 104 С рубашки.

26

46

I

Поток, вытекающий из колонки, контролируют с помощью записывающего поляриметра, откалиброваннога на значения от 50 до 58Ж фруктозы.

Собирают фракции по 5 мл до тех пор, пока не получают значения содержа-. ния фруктозы 55Х или выше, после чего эксперимент заканчивают. Во время отоора образцов полученный на выходе продукт немедленно охлаждают в ледяной бане, и рН устанавливают примерно 4,0, добавляя 1 M раствор лимонной кислоты (0,1 мл), затем разбавленную НС1.

Изомеризованные растворы, полученные нэ реакторов 70 и 103,3 С» анализируют на содержание углеводов ч окраску. Полученные результаты сравнивают с аналогичными данными для неиэомеризованного раствора субстрата (табл. 9).

Полученные результаты показывают, что достигают уровня 56,37. фруктозы при содержании псикозы менее

0,2 мас.X в расчете на сухую массу. "

Hp и м е р 10. Демонстрирует непосредственную иэомеризацию раствора, содержащего ггпокоэу, который состоит из очищенного гидролизата кукурузного крахмала с небольшой концентрацией соли, для достижения композиции 55,4 фруктозы в расчете на сухую массу при использовании процесса двухстадийной изомериэации.

Вначале проводят низкотемпературную иэомеризацию при 70 С, полученный продухт используют в качестве сырья во втором высокотемпературном (112,6 С) реакторе, содержащем химически стабилизированную иэомераэу.

Химически стабилизированная изомераза представляет собой иэомеразу, в которой фермент ковалентно связан с растворимым полимером во множестве точек, а затем продукт превращен в нерастворимый для получения иммобилизованного катализатора.

Гидролиэат получают из кукурузного крахмала по способу, описанному в па-.енте США 9 3644126 (ожижение) и патенте (;f!IA h" 3280006 (осахаривание).

Сироп очищают по способу патента

США 11 - 3834940 для получения продукта, содержащего 93,8Х глюкозы s расчете на сухую массу. Добавляют достаточное количество кристаллической глюкозы для доведения полного содержания глюкозы 96,9Х в расчете на

37 15 сухую массу, Полученный раствор имеет следующий состав:

Всего сухого вещест- ва, %. 50,3

Глюкоза, Х в расчете на сухую массу 96,9

Фруктоэа, Х в расчетена сухую массу 0,1.

Полисахариды, Й в расчете на.сухую массу 3,1

Псикоза, Я в расчете на сухую массу, 0,0

NaHSO, мМ 2,5

XgSO,, и 2 5

СОС1, MN 0,1 рН 6,0

Низкотемпературную изомеризацию о ,проводят при 70 С, прокачиная вышеуказанный раствор субстрата через ниэкотемпературный реактор, который описан в примере 1,.со скоростью

2,5 мл/мин. Первые 1000 мл, поступающие из реактора, сливают. После этого поступающий из реактора про. дукт используют на второй стадии, высокотемпературной стадии изомеризации.

Химически стабилизированный ката-. лизатор, используемый в высокотемпературном реакторе, приготавливают следующим образом. Растворимую глюкозоиэомеразу подготавливают и очищают по способу примера 1. Удельная активность этого препарата составляет около 40 IGIU/ìã протеина. Раствор растворимого полимера, полиамин, получают, растворяя 48,4 г хитозана в 15 л 0,08 í. ÍC1. После растворе-. ния хитозановый раствор доводят до 0,5 М в NaC1, добавляя 438 г NaCl и рН полученного раствора устанавливают 6,1 с помощью 3 н. NaOH. Затем хитозановый раствор фильтруют через бумажный фильтр Ватман ф 3 для удаления нерастворимого материала.

К 15 л 0,3% хитозана в 0,5 М NaC1 при рН 6,1 добавляют 520 мл растворимой изомеразы, содержащей около

602000 IGIU активности, 236 г ксилитола и 3,07 г MnC1< 4Н О. Зтот раствор перемешивают в течение 2 ч, после чего 7,44 г 1-этил-3-диметиламинопропилкарбодиимида добавляют для ковалентного связывания во множестве точек карбоксильных групп изомеразы с аминогрупами хитозана.

Через 2 ч при комнатной температуре в реакционную среду добавляют 15,5 мл

23056 38

5 IQ

30

50Х (мас./мас. ) растнора глутаральдегида с установленным значением рН 6,0 .с помощью 8 н. NaOH, для реакции, н результате которой ковалентный изомераэа-хитозан комплекс становится нерастворимым. Спустя

15 мин 4 л 1 М фосфатного раетвора при рН 8,0 .смешивают с нерастноримым продуктом изомераза-хитозан.

Иммобилизованную изомеразу-хитозан ! промывают деионизированной водой на бюхнеровском вакуумном фильтре с .фильтровальной бумагой Ватман ф 3.

Полученный продукт сушат на воздухе, измельчают и просеивают сквозь сито в интервале 12-60 мешей. Сухой катализатор обладает выраженной активностью 803, IGIU г.

Реактор на 112,6 С подготавливают следующим образом, Порцию катализатора (7,0 г) суспендируют в субстрате и деаэрируют в условиях лабораторного вакуума при комнатной температуре в течение 60 мин. Деаэрированную взвесь используют для получения слоя насацки 1,0i40 см н стеклянной колонке с рубашкой.

Слой насадки содержит 5621 IGIU. рН субстрата, полученного на первой стадии изомериэации при 70 С, устанавливают 6,55 и субстрат разбавляют деионизированной водой до содержания 42,0". сухого вещества, что также снижает концентрацию соли до 2,1 мМ для NaHHO и 2,1 мМ для NgHO .

Затем полученный субстрат прокачивают через колонку высокотемпературного реактора под давлением в течение 10 мин со скоростью потока

8 мл/мин при 60 С. Температуру в колонке контролируют с помощью термометра, расположенного непосредственно над слоем и окруженного песком вплоть до температурной шкалы для минимизации мертвого объема, насколько это возможно. Температуру колонки резко повышают за счет циркуляции масла из термостатированной при 112,6 С бани, скорость потока о снижают до 1,89 мл/мин, Вытекающий из колонки поток контролируют с помощью записывающего поляриметра, откалибро анного на значения от 50 до 58Х фруктозы. После того, как температура в колонке о достигает 112,6 С, а содержание фруктозы в вытекающем потоке достигает

1523056

Реактор на 105 8 С подготавливают следующим образом. Порцию катализатора 5,63 г суспендируют в субстрате и деаэрируют в условиях лабораторного вакуума при комнатной температуре в течение 60 мин. Деаэрированнув взвесь используют для получения 1,0 32 см слоя насадки в нужного уровня, вытекающий поток со-" бирают..рН немедленно устанавливают 4,0, добавляя 1 М лимонную кислоту. Вытекавший поток собирают до

5 тех пор, пока уровень фруктозы не падает ниже 55%

Иэомериэованные растворы, полученные при 70 и 112,6 С, аналиэиру» ют на содержание углеводов и окраску, полученные результаты сравнива-, ют. с аналогичными результатами, по- лученными для раствора неизомеризованного субстрата (табл. 10).

Полученные результаты,показывают, что 55,4% фруктозы можно достичь при сохранении уровня псикозы ниже

0,2 мас.% в расчете на сухую массу при окраске менее 9 (C1RF<100).

Пример ll. Демонстрирует непосредственную изомеризацию глюкозосодержащего раствора, состоящего, главным образом, иэ очищенного гидролиэата кукурузного крахмала с низким содержанием солей для достижения 25 композиции с 54,8% фруктозы в расчете на сухую массу при черезвычайно низком содержании псикозы (менее

0,1%) и окраске менее 2{С)Нрх100) при использовании двухстадийного 30 процесса. Первый (низкотемпературо ный) реактор функционирует при 70 С, а второй (высокотемпературный) реак- тор — при 105,8 С. Химически стабилизированная изомераза, которую используют в высокотемпературном реакторе, представляет. собой изо-. меразу, в которой фермент ковалентно связан с растворимым полимером во множестве точек, а затем этот продукт превращен в нерастворимый для получения иммобилнзованного катализатора..

Субстрат и его превращение в ре» о акторе на первой стадии при 70 С описаны в примере 5.

Иммобилизованный катализатор, который используют в высокотемпературном реакторе при 105,8 С, такой, как описан в примере 5.

50 стеклянной колонке с рубашкой, Слой насадки содержит 4521 XGlU. g .

Субстрат, полученный на первой стадии при 70 С иэомеризации, довоо дят до рН-6,5 и разбавляют деионизированной водой до достижения

42,0% сухого вещества, что, в свою очередь, снижает концентрацию сади до 2 1 мМ для М ЯО и 2,1 мМ для

БаНЯО . Затем такой субстрат прокачивают через колонку высокотемпературного реактора под давлением со скоростью потока 8 мл/мин в течение

10 мин при 60 С. Температуру внутри колонки контролируют термометром„ расположенным непосредственно над слоем насадки и окруженным песком до начала температурной шкалы для минимизации, насколько это возможно, мертвого обьема. Затем температуру колонки резко повышают эа счет циркуляции через рубашку масла из термостатированной при около 107 С бани.

Поток, вытекающий из колонки, кднтролируют с помощью записывающего цоляриметра, откалиброванного в интервале значений от 50 до 58% фрук- тозы. После того, как температура колонки достигает 105 8 С и когда содержание фруктозы в выходящем потоке достигает нужного уровня, этот вытекающий поток собирают. Его рН немедленно устанавливают 4,9, добавляя 1 М лимонную кислоту.

Изомеризованный раствор из реакторов функционирующих при 70 и

105,8 С, анализируют на состав углеводородов и окраску, полученные результаты сравнивают с аналогичными результатами, полученными для раствора неизомеризованного субстрата (табл. 11)..

Полученные результаты показывают, что можно достичь содержания фруктозы 54,8%, сохраняя уровень псикЬзы менее 0 1% в расчете на сухую массу, а окраску менее 2 (CIBFм 100).

Формула из об ретения

1„Способ изомеризации глюкозы во фруктозу, включающий контактирование исходного раствора с содержанием 40 — 50 мас.% глюкозы c,* термически стабильной глюкозоизомеразой при рН 6,0-7,0 и последующее охлаждение изомеризованного раство42

1523056 ра, отличающийся тем, что, с целью уменьшения образования псикозы и других несахаров в процессе изомеризации и повышения содержания фруктозы в растворе, контактирование исходного глюкоаосодержаще.го раствора с термически стабилизированной глюкоэоизомераэой проводят

Таблица 1

Состав углеводов, мас.Ж, в расчете на беээольную сухую массу

Обработка раствора

Фрук- Глю- Нси- Поли- Окраска тоза коза коза саха- (С?ВРк100) риды

0 99,6 О 0,4

52,3 47,3 0,1 0,4

55,5 43,7 0,4 0,4

0,6

2,1

4,8

Фрук- Глютоза коза

Таблица 2

Обработка раствора Состав углеводов, мас.Ж, в расчете на беззольную сухую массу

Пси- Поли- Окраска коза саха- (CIBF<100) рид

Неиэомеризованный

Изомериэованный при 97,4 С

0,1 97,1 0 2,8

55,2 42,4 0,2 2,2

0,6

Таблица 3

Обработка раствора Состав углеводов, мас.Х, в расчете на беззольную сухую массу

Фрук- Глю- Пси- Поли- Окраска тоза коза коза саха- (CIHF 100) рнд

О 97,6 0 2,4

51 3 46,4 О 2,3

55,3 41,8 0,3 2,6

0,5

О,?

35,2

Неизомеризованный

Изомеризованный при 70 С

Изомеризованный при 93 С

Неизомеризованный

Изомериэованный при 70 С

Изомериэованный при 97 С при 90-115 С и 10-25 мнн до превращения по крайней мере 54-58Х глюкозы во фруктоэу.

2. Способ rro n. 1 о т л и ч а ю шийся тем, что используют химически стабилизированную глюкозо" изомеразу, 1523056

Таблица 4

Окраска (CIRF <100) Фруктоза

1mo коза коза

0 992 0

0,8

0,6

Таблица 5

Состав на

Глюкоза

Псикоза

Фруктоза

ПолиОкраска (CIBF elÎÎ) сахарид

0,5

0,7

43,6

Таблица б

Фрук тоза

Псикоза

0,5

0,7

14,1,Обработка раствора

Неизомеризованный

Изомеризованиый при 70 С

Изомеризованный при 97,8 С

Обработка раствора

Неизомеризованный

Изомеризованный при 70 С

Изомеризованный при 302 С

Обработка раствора

Неиэомеризованный

Изомеризованный при 70 С

Изомеризованный прн 105,2 С

Состав углеводов, мас.Х, в расчете на беззольную сухую массу

52,3 46,9 0 0,8

55,8 43,8 0,2 0,2 углеводов, мас.X в расчете беззольную сухую массу

О 976 О 24

51,3 46,4 0 2,3

55,5 42,0 0,2 . 2,3

Состав углеводов, мас.X в расчете на беззольную сухую массу

Поли- Окраска саха- (CIHFx100) рид

О 976 0 24

51,3 46,4 О 2,3

55 5 41 б О 3 2 6

1523056

46

Таблица 7

Фруктоза

Глю- Пси" коза коза

0,5

51,7

Т аб лица 8

Окраска (CIRFr100) риды

0,6

0,7

19,8

Таблица 9

ФрукГлюкоза гоза

97,6 О

2,4

0 5

0,7

34,0

Обработка раствора

Неизомеризованный

Изомеризованный при 70 С

Кзомеризованный при 101,6 С

Обработка раствора

Неизомериэованный

Изомериэованный при 70 С

Изомеризованный при 110,4 С

Обработка раствора

Неиэомеризованный

Изомериэованный при 70 С

Иэомериэованный при 103,3 С

Состав углеводов, мас.Ж, в расчете на беззольную сухую массу

Поли- Окраска саха- (CIRF 100) рид

0 97,6 0 2,4

51,3 46,4 0 2,3

55,2 42,1 0 2,7

Состав углеводов, мас.Ж, в расчете на беэзольную сухую массу

Фрук- Глю- Пси- Политоэа коза коза саха0 99,2 0 0,8

52 3 46 9 0 - 0 8

57,2 41,5 0 3 1,0

Состав углеводов, мас.7, в расчете на беээольную сухую массу

Пси- Поли- Окраска коза саха- (CIRFx100) рид

51,3 46,4 0 2,3

56,3 4!,5 0,5 2,2

1523056

Таблица 10

Обработка раствора Состав углеводов, мас.й, в расчете на беззольную сухую массу

Фруктоза

Глюкоза

Псикоза

ПолиОкраска (CIRFxl00) сахаРиды

0 969 0 31

51,4 45 9 0 2,7

55 4 42,0, 01

2,5

Таблица ll

Обработка растворов

Состав углеводов, мас.Ж, в расчете на беэзольную сухую массу

Фрук- Глю- Пси- Поли- Окраска тоза коза коза саха- (СХВУ 100) риды

ñ01 969 0 31

51 4 45 9 0 2 7

54,8 42,3 (0,1 2,8

Составитель Г. Лошкарева

Техред Jf,CàðäþêîâàKîððåêòîð Л. Бескид

Редактор Н. Киштулинец

Заказ 6984/59 Тираж 311. Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж"35, Раушская наб., д. 4/5

«3

"1

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

Неизомеризоваи

Изомеризован при 70 С

Изомеризован при 112,б С

Неизомеризованный

Изомеризованный при 70 С

Изомеризованный при 105 С