Способ получения протопластов плодовых растений

 

Изобретение относится к биотехнологии и может применяться в генетике, селекции, физиологии и клеточной инженерии растений. Целью изобретения является повышение выхода протопластов. Способ состоит в использовании для гидролиза клеточных стенок растений новой композиции пектолитических и целлюлолитических ферментов. Способ позволяет получить большое количество протопластов с высоким содержанием жизнеспособных, пригодных для нужд клеточной селекции. При этом используются ферменты микробного происхождения, что позволяет обходиться без дорогостоящих импортных ферментов. 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (!) 4 С 12 N 5/00 Г"P.5".<3

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4297932/30-13 (22) 06.07.87 (46) 07.12.89. Бюл. N - 45 (71) Центральная генетическая лаборатория им. И.В.Мичурина и Всесоюзный научно-исследовательский институт микробиологических средств защиты растений и бактериальных препаратов (72) Н.M.-X.Нафталиев и Р,H,Ãðåáåøoва (53) 578. 085. 23(088. 8) (56) Авторское свидетельство СССР

Р 718052, кл. А 01 G 7/00, 1978 ° (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ

ПЛОДОВЫХ РАСТЕНИЙ

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции, в генетике и физиологии растений для получения протопластов.

Целью изобретения является повышение выхода протопластов.

Способ заключается в повышении суспензионной культуры клеток и инкубации их в растворе композиции ферментных препаратов, при этом в качестве ферментиых препаратов используют пектофоетидин, целлюконингин и целлобиаэу в концентрации О,1

2 0Х каждого. Активность ферментов при этом составляет, ед./г: пектинаэа 36-40; 1,4-(3-D-глюкан-целлобиогидролаэа 45-50; 1,4-Р-глюканаза 50-55; экзо-1,4-Р-глюкоэидаэа 35-40; целлобиаэа 180-200.

„„SU„„1527258 A 1

2 (57) Изобретение относится к биотехнологии и может применяться в генетике, селекции, физиологии и клеточной инженерии растений. Целью изобретения является повышение выхода протопластов. Способ состоит в использовании для гидролиэа клеточных стенок растений новой композиции пектолитических и целлюлолитических ферментов, Способ позволяет получить большое количество протопластов с высоким содержанием жизнеспособных, пригодных для нужд клеточной селекции. При этом используются ферменты микробного происхождения, что позволяет обходиться без дорогостояЮ ших импортных ферментов. 4 табл.

Способ осушествляется следуюшим образом.

В суспензионную культуру клеток вносят ферментный раствор пектофоетидина, целлюконингина и целлобиазы в концентрации 0,1 — 2,0Х. Инкубацию о проводят в термостате при 26 С в течение 16 ч. Осаждение протопластов осУшествляют с помошью центрифуги, Основное требование, предъявляемое к подбору композии ферментов, состоит в том, чтобы все выделенные протопласты имели шаровидную форму с равномерным распределением хлоропластов.

Пример 1. Испытывают влияние ферментных препаратов пектофоетидина, целлюконингина и целлобиаэьг на

1527258

35 количественный выход изолированных протопластов иэ клеток листьев смородины и каллусной ткани земляники.

Суспензионную культуру клеток смородины (сорт Память Мичурина) выделя5 ют из розеток листьев, выращенных из апикальных меристем в условиях стерильной культуры на искусственной питательной среде.

l0

Суспенэионную культуру клеток земляники (сорт Рубиновый кулон) выделяют иэ каллуснок ткани, выращенной в условиях стерильной культуры на искусственной питательной среде. 15

Пектофоетидин, целлюконингин и целлобиазу (образцы промышленных препаратов) вносят в концентрациях 1,0 и 2,0Х. Опыт ставят в трехкратной повторности. В качестве контроля испытывают ферментный препарат — иектинаэу (очищенную без наполнителя) в концентрации 1Х. Все ферменты растворяют в смеси растворов 0,4 M Dманнит, О, 3 М CaC3.> и 0,7 М ИаНРОд . 25

В вариантах, где применяют пектофоетидин, целлюконингин, и целлобиаэу, почти все иротопласты листа смородины и каллусной ткани земляники освобождаются от клеточных стенок и оказываются сусиендированными в инкубационной смеси. Существенных различий по количественному выходу изолированных протопластов от применения каждого из этих ферментов не наблюдается.

Выход жизнеспособных протоиластов из 1,0 г листовой ткани смородины при использовании пектофоетидина составляет 7,5 10 и,/мл, ири ис5

40 пользовании целлюконингина — 5,8 "

<10 п./мл ири применении целлобиа6

6 эы — 6,4 10 п./мл (табл. 1), На таком же уровне наблюдается содержание изолированных иротоиластов в контроле (1,0 10 п„/мл), где

7 45 применяют пектиназу.

Содержание изолированных протопластов из клеток,каллусной ткани земляники при использовании Нектофоетидина, целлюконингина и иектинаэы составляет 1,2 10 п./мл, а при исб

7 пользовании целлобиаэы — 1,0 10 п. /мл.

Данные опыта показывают, что предлагаемые ферменты — пектофоетидин, целлюконингин и целлобиаза обладают комплексом ферментных систем, активно разрушающих клеточные стенки плодовых культур и сиособствующих получению жизнеспособных ирптоиластов, причем эффективность ферментов значительно выше, чем в известных способах (табл, 2-4).

Таким образом, предлагаемый способ получения протопластов расширяет использование композиции из целлюлолитических и пектолитических ферментов, которые могут с успехом заменить импортные препараты при получении протопластов плодовых культур, а также снижаются затраты времени и денежных средств.

Для доказательства жизнеспособности протопластов используются такие красители, как триисиновый синий или метиленовый синий. Отбирается часть окрашенной суспензии протопластов (равный объем суспензии протоиластов и 0 1Х-ного трипсинового синего), пастеровской пипеткой заиолняется сетчакая камера Фукса-Розенталя, определяется концентрация живых иротопластов н исходной сусиензии.Окрашенные иротопласты нежизнеспособны. Жизнеспособные протопласты не окрашиваются.

Результаты проведенных исследований показали, что после первого дня культивирования жизнеспособность протопластов, выделенных из клеток листовой ткани смородины сорта Память

Мичурина, иод влиянием ферментов— иектиназы, иектофоетидина, целлюконингина и целлобиаэы различается в пределах 70-80Х, У других видов и сортов смородины (Rubus americanicum и сорт Голубка) жизнеспособность протоииастов находится на уровне 60-80Х.

Жизнеспособность протопластов, выделенных из клеток каллусной ткани земляники сорта Рубиновый кулон составляет более 90Х протопластов ° У других видов и сортов земляники (Fragaria maschata и Фестивальная) жизнеспособность протопластов 60-90Х.

Указанные ферменты положительно используются в работах по выделению других видов плодовых растений (яблоня и груша).

При оптимальных условиях культивирования протопласты регенерируют клеточную стенку, клетки делятся с образованием клеточных колоний и формируют каллусные ткани. Успешно выделенные протопласты иод влиянием ферментов — пектиназы, иектофоетиди7258 6 шения выхода протопластов, в качестве ферментных препаратов используют пектофоетидин, целлюконингин и целлобиаэу в концентрации 1,0 — 2,0Х каждого, причем активность ферментов при этом составляет, ед./г:

152 на, целлюконингина и целлобиазы используются в исследованиях по соматической гибридизации (гибридизация клеток методом слияния изолированных протопластов).

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

36-40

Способ получения протопластов плодовых растений, включающий получение суспенэионной культуры клеток и инкубацию их в растворе композиции ферментных препаратов, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью повы45-50

50-55

35-40

180-200.

Таблица) Источники Количество Условия изолирования протопластов протопластов в суспенэнонной

Осмотический с таб ил из а то р

Время инкубации, ч

Концентрация

Ферментный препарат ферментного культуре, и./мл репараа, 7

1,0 10

0,4И D-Маннит 16

0,3М СаС1

0,7М NaHPOg

1,0

Клетки листовой ткани смородины

7,5 10

5,8 10

1,0

То же

2,0 нингин

Целлобиаза

Пектиназа (очищенная без наполнителя)

Пектофоетидин

Целлюконин6,4 ° 10

1,2 ° 10

l6

2,0

1,0

Клетки каллусной ткани земляники

1,0

2,0 гин

Целлобиаза и»

2,0

1,2 10

1,2 10

1,0 .10

Пектиназа (очищенная без наполнителя)

Пектофоетидин

ЦеллюкоПектиназа

1,4-P-D-Глюканцеллобиогидролаза

1,4-P-Глюканаза

Экзо-1,4-J3-глюкозидаза

Целлобиаэа

1527258

Таблица 2

Условия изолирования протопластов

Количество протопластов в суспенэионной культуре ° и./мл

Источники

Концентрация ферментного препарата, Х

Активность ферментов в препарате, ед./г

Ферментный препарат

Вреня инкубации, ч

Осиотнческий стабилизатор

4,1 109

0,5

ПектннВ9В (ОЧ>%1ЕННВЯ без наполнителя) 0,4М 0-Мвннит 16

36 О,ЗМ Caolз

45 0,7М NaHPO+

180

Клетки лнстоsall ткани смородины

Обная пектиназная активность

Целлобиогидроляна

ЭНДО ГЛЮКВНВ9В

ЭКЭО ГЛЮХО9НДВ9В

Цеплобиаза

Обмая пектиназная

З,О. 1 oã

0,5

То вв

Пектофоетидии

То не

38

SO

38

1 80 активность

ЦЕЛЛОЬИОГИДРОЛВ9В

ЭХ9О ГлюхОэидВ9В

Целлобиа9а

2 ° 4 1О

0,5

Целлобиогндролаъа

Целлюконннгнн

Эидо-глюханаза

Экзо-глюкозидаза

Целлобиаэа

7,0 lo

1,0

Целпобиаза

Целлобиогндролаза

Эндо-глюканаза

Экзо-глвхозидаза

Пектииаэа (оч>манная беэ неполнителя) Целлабнвэа

Обэ>ая пектиназная

9,0 10

Клетки каллусной ткани земляники активность

Целлобиогидролаза

Эндо-глвканаза

ЭХ9О ГЛЮКО9ИДВЭВ

ЦВЛЛОЬИВ9В

Обвая пектиназная

7,3 lo

О,S

То re

Целлюконннгнн

То ве активность

Целлобногидролаза

38

42

48

38

53

38

180

Эидо-глюканаза

Экзо-глюкозидаза

Целлобиаза

Целлобиогндролаза

8,6 IO

Целлвконингин

l,O

6,0 10

1,0

Целлобназа

Таблица 3

Условия изолирования протопластов т Концентрация ферне71т- t ного препарата> Х оличество ротопластов суспемэионой культуре, п./мл

Осмотическмй стабилизатор

Активность ферментов в препарате, ед./r

Время инку0arrM ч

Ферментный препарат

7,0 10

0,4Н П-Наннит 16

О,ЗН СВС19

0,7Н ПВПРО

0 5

Обная ЛВктинВ9ная активность

Пектнназа (оч>еэениая беэ наполннтеля) Клетки листовой ткани смородины

42

Целпобиогидролаза

Эндо-глюканаэа 52

Экэо-глвкозндаэа. 38

Целлобиаэа 185

8,1 l o

То re

0,5

Обвея пектинаэнвя активность

ЦеллОбнОГидрОлВ9В

Эндо-глвказидаза

Пектофоетидин

То rc

Целлобиаэа 150

6,8 10

1,0

Целлобиогидролаза

Эндо-глвканаэа

Экэо-глюкозидаза

Целлобиогидролаэа

Эндо-глвканаза

Экзо ГлюхО9идаэВ

Целлвконннгин

7,7 ° 10

l,O

ЦеллОЬ НВ9 В

Эндо-глюкаиаза

ЭК9О ГЛЮКО9ИДВ9В

Целпобназа

Целлобногидролазв

Эндо-глюканаза

Экэо-глюкозидаэа

Целлобиаза

35 0,4М D-Нвннит 16

42 О,ЗН СВС19

48 0,7М НаНР09

33

180

)52/258

Продолжение табл.3 условя

Количество протопластов я изолирования протопластов

Источники

Ьремя инкубации, Осмотическнй стабилизатор

Активность ферментов в препарате, ед./г

КонцентФерментный препарат пензионв сус ной к ультуре, /мл рация ферментного препарата, t

Целпобиаээ

Обшая пектнназная активность

Целлобиогидролаза

Эндо-глюканаэа

Экзо-глюкоэидаза

Целлобиаза

Обвал пектиназная

200 о

Клетки каллусной ткани земля0,5

l,О 10

Пектиназа (очищенная без наполнителя) 0,4M D-Ианнмн

0,3 СаС1э

0,7И НвНРОа

38

43

56

38

185 ники

1,7 ° 10

Пектофоетидин

То ве

0,5

То ве

I,1 10

ЦеллюконинI,О

1,2 I O

1,0!

Целлобиаза

Т а б л и ц а 4

Источники

Ферментный препарат - Количество протопластов в суспенэионной культуре, п./мл, в зависимости от концентрации ферментнык препаратов, 1

1,0а" 0,5" 0,5еа

2,0 1,5 1,0"

Клетки листовой ткани смородины сорта Память

Иичурина

I,О 10

7,5 10

4,1 10

3,0 ° 10

0,8 АЙ !0

8,0

7 ° О 10

8,1 10

6 ° 8 IО

7,7 ° 1О

5,8 10

6,4 ° I O

8,1 10

7,!! I O

2,4 10

7,0 10. Клетки каллусной ткани земляники

Рубиновый кулон

I,6 !О

1,3 10

1,7. 10

I,? !О

9,0 10

7,3 IO

1,0 10

I,7 IO а

l,0-1О

1,1 10

1,2 10

1,0 10

8>6 10

6,0 1О

I 1 10

1,2 ° 10 а

° Нивний предел активности ферментов.

° внаксимальный предел активности ферментов.

Составитель В. Демкии

Техред М.Дидык

Корректор Т. Палий

Редактор О. Юрковецкая

Заказ 7481/34 Тираж 501 Подписное т ниям и открытиям при ГКНТ СССР

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

"Патент" r.Óæãoðoä, ул. Гагарина, 101

Производственно-издательский комбинат а

Пектолитнческие ферменты: пектннаэа (очишенная без наполнителя) пектофоетидин

Целлюлолитическне ферменты: целлюконингин целлобиаза

Пектолитические ферменты: пектинаэа (очищеннал беэ наполнителя) пектофоетидин

Целлюлолнтическйе ферменты: целлюконннгин целлобнаэа активность

Целлобиогидролаэа

Эндо-глюканаэа

Экэо-глюказидаза

Целлобиаэа

Целлобиогндролаэа

Эндо-глюканаэа

Экэо-глюкоэндаэа

Целлобнаэа

Целлобиогидролаэа

Эндо-глюканаэа

Экзо-глюкозидаза

Целлобиаэа

48

52.

185

55

200

55

200