Штамм гибридных культивируемых клеток животных -mus мusсulus -продуцент моноклональных антител к возбудителю амиотрофического лейкоспонгиоза

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при приготовлении диагностических препаратов. Штамм АЛМА-7 депонирован под номером ВСКК(П) N 223Д. Получают штамм путем иммунизации мышей линии BALB/C белком PRP с мол.м 27-32 кДа по схеме. Активированные лимфоциты сливают с миеломными клетками X63-AG8/653 в соотношении 4:1 с использованием ПЭГ 4000. Гибридома продуцирует моноклональные антителя JGG 2а класса. Стабильная продукция антител на протяжении 29 пассажей. Штамм на мышах не перевивается. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ П(НТ СССР (21 ) 41 92687/28-13 (22) 05.01.87 (46) 07.12.89. Бюл. У 45 (71) Белорусский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (72) В.И. Вотяков, И.B.Èàëàõoâà, Н.Д.Коломиец, Л.Я.Куницкая,А.Г.Коломиец и В.II.Ëó÷êo (53) 578.085.23(088.8) (54) IIITANN ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ вЂ” MUS MUSCULUS

ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЪНЫХ АНТИТЕЛ К

ВОЗБУДИТЕЛЮ АМИОТРОФИЧЕСКОГО ЛЕЙКОСПОНГИОЗА

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при приготовлении диагностических препаратов.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/с с массой 1820 r иммунизируют белком prp с мол. м. 27-32 кДа, полученным путем последовательной обработки мозговой суспензии нуклеазами, протеазаяи, детергентами в сочетании с градиентным центрифугированием, по схеме:4кратно через каждые 7 дней вводят внутрибрюшинно по 0,1 мл белка prp с полным адъювантом Фрейнда. Концентрация белка prp составляет

1,0 мг/мп. Через 7 дней после последней иммунизации вводят в селезенку бустерную дозу белка в объеме 0,1 мл .

„„SU„„1527257 A 1 (gII 4 С 12 N 5/00, А 61 К 39/395

2 (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при приготовлении диагностических препаратов. Штамм АЛМА-7 депонирован под номером ВСКК(П)

11 223Д. Получают штамм путем иммунизации мышей линии BALB/ñ белком

prp с мол.м 27-32 кДа по схеме. Активированные лимфоциты сливают с миеломными клетками Х63 Ag 8/653 в соотношении 4:1 с использованием

ПЭГ 4000. Гибридома продуцирует моноклональные антитела IgG 2а класса.Стабильная продукция антител на протяжении 29 пассажей. Штамм на мышах не перевивается. 1 табл.

На 3-й день. после бустерной дозы белка у мышей извлекают селезенки и готовят суспензию активированных а лимфоцитов, используемую для слияния с перевариваемыми миеломными клетками Х63-Ag 8/653 в соотношении 4: 1 .

Слияние клеток проводят с использованием 503-ного раствора полиэтиленгликоля 4000. Гибридные клетки культивируют на селективной среде ГАТ (гипоксантин — аминоптерин — тимидин). Из 125 клонов, образовавшихся при слиянии с родителем Х63 Ag

8/653, обнаружено 9 гибридных клонов, дающих специфическое связывание с белком prp в реакции иммунофермент1 ного анализа. Путем серийных пассажей клетки наиболее продуктивного клона АЛМА-7 выведены в массовую

1527257 культуру. При прививке линейным мьг

maM BALB/с клеток АЛМА-7 в дозе 6-l2 10 индуцируют образование асцит6 ных опухолей.

Полученный штамм АЛМА-7 депонирован под номером ВСКК(П) ll 223Д и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. 10

Культура состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату округлых клеток различной величины с ядрами, занимающими большую часть клетки, Ядрьппки крупные, встречаются двуядерные клетки. Цитоплаэма имеет вид тонкого ободка, или ядро смещено к одной стороне клетки.

Культуральные признаки.

Среда для культивирования - среда

Дульбекко с 15Х эмбриональной телячьей сыворотки, пируватом натрия, 4 г/q глюкозы, 2 мМ глютамина, 50 мкг/мл антибиотика гентамицина. Характер роста — стационарная суспензия. Метод 25 снятия — встряхивание. Частота пассирования — через 2-3 сут. Посевная доза 150000 клеток в 1 мл . Кратность рассева (1:3)-(l:5). Стабильная продукция антител на протяжении

29 пассажей.

Культивирование in vivo, При прививке линейным мышам BALB/с клетки АЛМА-7 в дозе 6-12 10 инду6

35 цируют образование асцитных опухолей в среднем через 18 дней. Мьппей предварительно (не менее чем sa 5-7 сут до введения клеток) обрабатывают пристаном в дозе 0,4-0,5 мл на мьппь для улучшения асцитообразования. От одной мьппи в среднем получают 3,0 мл асцитической жидкости. Асцитическую жидкость осветляют путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение

10 мин. IgG осаждают сульфатом аммония (ЭОХ насыщения) и чистят путем аффинной хроматографии. Штамм АЛМА-7 на мышах не перевивается.

Характеристика продукта.

Класс продуцируемых иммуноглобу50 линов - IgG2a. Продуцируемые антитела охарактеризованы в точечном иммуноферментном методе (ТИФМ).

Изоферменты.

Подвижность глюкоза-6-фосфатдегид-55 рогеназы и лактатдегидрогенаэы в клетках клона АЛМА-7 характерна для мышиных клеток.

Контаминация.

Бактерии не.обнаружены, грибы и дрожжи не обнаружены, микоплазмы не обнаружены, вирусы — обнаружены частицы типа А и С, аналогичные частицам родительского штамма клеток

Х63-Ag 8/653.

Консервация клеток.

Клетки АЛМА-7 заморожены на 22)

24 и 26 пассажах. Общее число ампул

40 по 5-7 млн клеток в ампупле. Криозащитная среда — ростовая среда с

50-60Х. эмбриональной телячьей сьворотки и 10Х глицерина. Выживаемость при размораживании 74Х.

Пример 1. Культивирование гибридных клеток и накопление моноклональных антител в культуральных (КЖ) и асцитических жидкостях (АЖ).

В культуральные матрасы объемом

250-500 мл засевают гибридные клетки АЛМА-7 в концентрации 150000200000 клеток/мл в среде Дульбекко с пируватом натрия, 15Х эмбриональной телячьей сьворотки, 4 г/л глюкозы, 2 мМ глютамина и 50 мкг/мл гентамицина. Культуры инкубируют при

37 С в стационарном состоянии 3-4 сут.

Клетки отделяют центрифугированием.

Надосадок хранят при минус 20 С и используют как образцы КЖ. Осадок клеток ресуспендируют в 1 мл среды без сыворотки и вводят в полость сингенных мышей. Через 12-15 сут образуется асцитная опухоль, которую используют как образец АЖ.

Пример 2. Определение специфической активности моноклональных антител ТИфМ °

На нитроцеллюлозные фильтры нано сят по 20 мкл очищенного белка 2732 кД АЛ, высушивают и отмывают 1 pas раствором, содержащим 20Х изопропкпоного спирта и 7Х уксусной кислоты, и

3 раза дистиллированной водой. Затем на 1 ч наносят буфер — 0,05 M трисНС1, РН 7,4 (буфер 1), содержащий

0,5Х желатина. После контакта на фильтры наносят исследуемые образцы о и помещают в термостат при 37 С на

1 ч, Отмывают 5 pas в буфере 1, содержащем 0,05Х тритона Х-100 (буфер

2) и 1 pas буфером 1. Наносят антимьппиный иммуноглобулин, меченый пероксидазой на 1,5 ч и помещают в термостат при 37 С, Отмывают 6 pas буфером 2, 1 раэ буфером 1 и 1 pas дистиллированной водой. Погружают в

1527257

Таким образом, моноклональные антитела могут слумить сырьем для получения диагностических препаратов.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Nus musculus BCKK(II)

В 223Д вЂ” продуцент моноклональных антител к возбудителю амнотрофического лейкоспонгиоза.

Титр антител к белку 27-32 кД, выделенному иэ нормальной ткани (контроль) Ис следуемый обТитр антител к белку 2732 кд АЛ разец

0

0

0

1:500

1:500

1:100

1:500

1:500

1:5000

1:10000

1:10000

КЖ 7

КЖ 12

КЖ 4

КЖ 10

КЖ 9

AN 9

АЖ 10

AN 7

Составитель Г. Смирнова

Техред М.Дидык Корректор Э.Лончакова

Редактор В. 10рковецкая

Заказ 7481/34 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, N-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.укгород, ул. Гагарина, 101

Ъ раствор 3 4-диаминобензидина с

0,005Х Н,0 на 5 мин и отмывают водой 5-6 раэ.

Реакцию считают положительной, если на фильтре образуется коричневое пятно .

Результаты проведенных исследований приведены в таблице.

Результаты, полученные ТИФИ, свидетельствуют, что моноклональиые антитела специфически реагируют только с белком prp 27-32 кД АЛСП и не ре" агируют с белком с такой ке молекулярной массой, полученным из нормальной ткани ЦНС.

Полученный штамм гибридных клеток

АЛИА-7 синтезирует высокоспецифические моноклональные антитела к белку

prp — возбудителю амиотрофического лейкоспонгиоза класса lgG, подкласса

2а, с титром в ТИФИ 1:10000 (АЖ).

Моноклональные антитела незаменимы для получения методом аффинной хроматографии высокоочяценных белков для изучения взаимосвязей между раз10 личными представителями группы прионов. Они могут оказаться полезными для изучения патогенеза заболевания и разработки новых методов прижизненной диагностики.

Формула изобретения