Способ определения повреждения мембран эритроцитов

 

Изобретение относится к медицине и биохимии и может быть использовано для определения повреждения мембран эритроцитов. Цель - повышение чувствительности способа. Мембраны эритроцитов, полученные гипоосмотическим шоком и обработанные ультразвуком, инкубируют с раствором эргокальциферола при 37°С 60 мин и проводят хемилюминесцентный анализ инкубационной смеси. Хемилюминесценцию индуцируют ионами двухвалентного железа. Регистрируют светосумму "быстрой" вспышки хемилюминесценции. При уровне светосуммы выше 700 имп/мин судят о повреждении мембран эритроцитов.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

29109 A i (19) (ll) (5)) 4 0 01 N 33/48! м,/ Я

3;Д, (J

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4161360/28-14 (22) 15.12.86 (46) 15.12.89. Бюл. )1- 46 (/1) Институт биохимии АН БССР и Гродненский государственный медицинский институт (72) В.С. Васильев, Г.К. Новицкий, В,М. Цыркунов, @.С. Ларин и Г.3. Абакумов (53) 612,015 (088.8) (56) Вопросы медицинской химии.

1981, t> 1, с. 108-112, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЯ

МЕМБРАН ЗРИТРОЦИТОВ (57> Изобретение относится к медициИзобретение относится к медицине и биохимии, в частности к способам оценки повреждения мембран эритроцитов.

Цель изобретения — повышение чувствительности способа за счет использования препарата мембран эритроцитов, обработанного эргокальI+ циферолом и Fe

Пример 1.Берут 5 мл венозной крови и вьщеляют из нее эритроциты, при этом в качестве антикоагулянта используют гепарин (2000 ед./мл), для этого кровь центрифугируют при

300 g в течение 10 мин, плазму и верхний слой эритроцитов, содержащий ,лейкоциты, удаляют. Затем производят трехкратную отмывку, добавляя четырехкратный объем охлажденного физиологического раствора, каждый раз осаждая клетки центрифугированием

2 не и биохимии и может быть использовано для определения повреждения мембран эритроцитов. Цель — повышение чувствительности способа. Мембраны эритроцитов, полученные гипоосмотическим шоком и обработанные ультразвуком, инкубируют с раствором

0 эргокальциферола при 37 С 60 мин и проводят хемилюминесцентный анализ инкубационной смеси. Хемилюминесценцию индуцируют ионами двухвалентного железа. Регистрируют светосумм быстрой вспышки хемилюминесценции. При уровне светосуммы выше

700 имп./мин судят о повреждении мембран эритроцитов.

1 при 300 и в течение 10 мин и удаляя надосадочную жидкость вместе с верхним слоем эритроцитов.

Мембраны эритроцитов выделяют путем гипоосмотического гемолиза, при этом в качестве гемолизирующей среды берут 5 мМ NaH>PO< содержащую

1 мМ ЭДТА, Один миллилитр осажденных эритроцитов быстро и энергично перемешивают с 20 мл охлажденной до 4 C гемолизирующей среды и выдерживают при этой температуре, периодически помешивая, 40 мин. Гемолизат центрифугируют при 20000 g в течение 20 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок мембран эритроцитов трехкратно промывают 20 объемами

10 мМ трис-НС1-буфера (рН 7,4, при

20 С), каждый раз осаждая мембраны центрифугированием при 20000 )(в течение 20 мин. Осадок мембран эрит1529109 роцитов переносят в мерные центрифужные пробирки и доводят 10 мМ трисHCl-буфером (pH 7,4) объем до 1,0 мл, Полученную суспензию мембран эритро-.

5 цитов обрабатывают ультразвуком при частоте 44 кгц с выходной электрической мощностью генератора в рабочем диапазоне частоты на активной нагрузке 360 Вт. К 0,2 мл обработанной

10 ультразвуком суспензии мембран эритроцитов добавляют 0,5 мл 0,5 -ного спиртового раствора эргокальциферола (конечная концентрация 0,08 .), доводя объем инкубационной смеси до 4 мл

10 мМ трис-НС1-буфером (рН 7,4), и инкубируют при 37 С 60 мин, Затем добавляют в инкубационную смесь 1 мл водного раствора с льфата двухвалентного железа (FehO< )npv. конечной концентрации его в кювете на 5 мл равной 5 ° !О Ò и на хемилюминометре, работающем в режиме счета фотонов, регистрируют светосумму инициированной ионами двухвалентного железа 25 быстрой вспышки хемилюминесценции инкубационной смеси при 37 С. Зарегистрированная светосумма отражает интенсивность свободнорадикальных процессов, соответствующую уровню со- 30 держания гидроперекисей липидов, увеличение концентрации которых и указывает на повреждение мембран эритроцитов.

Существенно, что мембраны эритроцитов без раствора эргокальциферола

35 не дают быстрой вспьппки хемилюминесцепции на введение ионов железа.

При обследовании мембран эритроцитов практически здоровых людей (50 чедовек) выявлено, что светосумма быстрой вспышки хемилюминесценции составляет 6200+800 имп./мин, При обследовании мембран эритроцитов больных с различной патологией (70 человек) 4 выявлено повышение светосуммы быстрой вспьппки хемилюминесценции инкубационной смеси, содержащей мембраны эритроцитов, до 12000-17500 имп./мин. Следовательно, при уровне светосуммы быстрой вспышки хемилюминесценции инкубационной смеси выше 7000 имп./MHH судят о повреждении мембран эритроцитов.

1I р и м е р .2. Зритроциты получают, как описано в примере 1. Эритроциты смешивают с раствором дигитонина при его конечной концентрации в инкубационной среде 2 мкг/мл;

10 мкг/мл и 20 мкг/мл. Инкубационная смесь содержит 1 мл осадка эритроцитов; 8,98 мл физиологического раствора и 20 мкл плазмы крови, содержащей соответствующую концентрацию дигитонина, После 20-минутного выдерживания, смесь центрифугируют и полученный осадок обработанных дигитонином эритроцитов, как и стандартный образец, используют для гипоосмотического гемолиэа (как описано в примере 1) и последующего определения

2+ светосуммы быстрой вспышки Fe -индуцированной хемилюминесценции.

Аналогичное исследование было проведено с использованием способапрототипа.

При большем повреждении мембран эритроцитов наблюдается более значительное нарастание светосумми их хемилюминесценции, измеренное по предлагаемому способу 7883 имп./мин, 10982 имп./мин, 15117 имп./мин, что подтверждает адекватность и достаточную чувствительность предлагаемого способа.

Формулаизобретения

Способ определения повреждения мембран эритроцитов путем обработки эритроцитов химическими реагентами, индуцирующими хемилюминесценцию, с последующей регистрацией уровня хемилюминесценции, о т л и ч а ю щ и .й— с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, мембраны эритроцитов обрабатывают ультразвуком и инкубируют в спиртовом растворе эргокаль 1иферола при конечной концентрации последнего 0,06, хемилю-. минесценцию индуцируют ионами двухвалентного железа, затем регистрируют светосумму быстрой вспышки хемилюминесценции, а при этом наличие повреждения мембран определяют при уровне светосуммы вспышки вьппе

7000 имп./мин.