Способ получения пептидов

 

Изобретение касается пептидов, в частности получения соединений общей ф-лы I: R<SB POS="POST">1</SB> - R<SB POS="POST">2</SB> - ASP - ALA - ILE - PHE - THR - R<SB POS="POST">8</SB> - SER - R<SB POS="POST">10</SB> - ARG - R<SB POS="POST">12</SB> - R<SB POS="POST">13</SB> - R<SB POS="POST">14</SB> - GLY - GLN - LEU - R<SB POS="POST">18</SB> - ALA - ARG - LYS - LEU - LEU - R<SB POS="POST">24</SB> - R<SB POS="POST">25</SB> - R<SB POS="POST">26</SB> - NLE - R<SB POS="POST">28</SB> - R<SB POS="POST">29</SB> - Y, где R<SB POS="POST">1</SB> - TYR, HIS

R<SB POS="POST">2</SB> - ALA, DNMA

R<SB POS="POST">8</SB> - SER, ASN

R<SB POS="POST">10</SB> - TYR, D=TYR

R<SB POS="POST">12</SB> - ARG, LYS

R<SB POS="POST">13</SB> - ILE, VAL

R<SB POS="POST">14</SB> - D=LEU, LEU

R<SB POS="POST">18</SB> - TYR, SER

R<SB POS="POST">24</SB> - HIS, GLN

R<SB POS="POST">25</SB> - GLN, ASP

R<SB POS="POST">26</SB> - ILE

R<SB POS="POST">28</SB> - ASN, SER

R<SB POS="POST">29</SB> - ARG, D=ARG

Y - NH<SB POS="POST">2</SB>, NHC<SB POS="POST">2</SB>H<SB POS="POST">5</SB> при условии, что или R<SB POS="POST">2</SB> - DNMA, или R<SB POS="POST">14</SB> - D=LEU, или R<SB POS="POST">29</SB> - D=ARG, которые способны вызывать секрецию природного гормона роста, что может быть использовано в медицине. Цель - создание новых более активных пептидов. Их синтез ведут из BOC-ARGTOS или BOC-D-ARG(TOS), который связывают с полимерной смолой MBHA или NEAM с последующим отщеплением BOC-защитной группы. Затем проводят постепенное наращивание пептидной цепи в последовательности, указанной в ф-ле I. Полученный пептидилполимер общей ф-лы II: X<SB POS="POST">1</SB> - R<SB POS="POST">1</SB>(X или X<SB POS="POST">2</SB>) - R<SB POS="POST">2</SB> - ASP(X<SB POS="POST">3</SB>) - ALA - ILE - PHE - THR(X<SB POS="POST">4</SB>) - R<SB POS="POST">8</SB>(X<SB POS="POST">4</SB> или X<SB POS="POST">5</SB>) - SER(X<SB POS="POST">4</SB>) - R<SB POS="POST">10</SB>(X<SB POS="POST">2</SB>) - ARG(X<SB POS="POST">6</SB>) - R<SB POS="POST">12</SB>(X<SB POS="POST">6</SB> или X<SB POS="POST">7</SB>) - R<SB POS="POST">13</SB> - R<SB POS="POST">14</SB> - GLY - GLN(X<SB POS="POST">5</SB>) - LEU - R<SB POS="POST">18</SB>(X<SB POS="POST">2</SB>) - ALA - ARG(X<SB POS="POST">6</SB>) - LYS(X<SB POS="POST">7</SB>) - LEU - LEU - R<SB POS="POST">24</SB>(X или X<SB POS="POST">5</SB>) - R<SB POS="POST">25</SB>(X<SB POS="POST">3</SB>) - ILE - NLE - R<SB POS="POST">28</SB>(X<SB POS="POST">4</SB> или X<SB POS="POST">5</SB>) - R<SB POS="POST">29</SB>(X<SB POS="POST">6</SB>) - X<SB POS="POST">9</SB>, где X - тозил

X<SB POS="POST">1</SB> - BOC

X<SB POS="POST">2</SB> - 2,6- дихлорбензил

X<SB POS="POST">3</SB> - OBZL

X<SB POS="POST">4</SB> - бензиловый эфир

X<SB POS="POST">5</SB> - ксантил

X<SB POS="POST">6</SB> - тозил

X<SB POS="POST">7</SB> - 2-хлорбензилоксикарбонил

X<SB POS="POST">9</SB> - смола-носитель MBHA или NEAM, подвергают деблокированию и отщеплению пептида от смолы-носителя с использованием фтористого водорода в сочетании с анизолом или метилэтилсульфидом, или их смесью в качестве акцептора при температуре от 0 до(-20)°С с последующим растворением полученного продукта в уксусной кислоте и очисткой, например, тонким фильтрованием через гель сефадекс G-50. Новые пептиды оказывают влияние на секрецию гипофизарных желез, что можно использовать для промотирования роста животных или в диагностической практике. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 3898058/23-04 (22) 17.05.85 (31) 6»844 (32) 18.05.84 (33) US (46) 15.12.89 ° Бюл. )" 46 (71) Дзе Салк Институт фор Биолоджикал Стадиэ (US) (72) Вили Уолкер Гейл-младший и Жан Эдуард фредерик Ривье (СН) (53) 547.964.4.07(088,8) (56) Химия полипептидов /Под ред.

П,Катсояниса, М.: Мир, 1977, с. 368.

Патент СГЮ )" 4105603, кл. С 07 С 103/52, ппублик. 1978. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ (57) Изобретение касается пептидов, в частности получения соединений общей ф-лы I: Р,-Е -Asp-Ala-Ile-PheThr в Ser ",о Атд Г <г-F,13-Г.14

-Gly-Г ln-Leu-Г << -Al а-Arg-1.у s-Leuк24 Рг,-г,„-tJle-йгв-F<> -Y, где

R<-Tyr, His; F. — Ala, 1) ))1А; F.

Ser, Asn; Е ц> — Tyr, D Tyr; Р,г

Arg, Lys; Ег) — Пе, Val) Г, 4—

Э-Leu, Leu; Ris — туг, Ser; Рг4—

His, Gln; В.г — Сlп, Asp; Р гб — Il e;

Кгв — Asn, Ser; F«> — Arg, D-Ага

Y ЕН, ИНСгН5, при условии, что или кг - ИЖА, или F.<4 = D 1.ец, или Кг,) — D-Агр, которые способны вызывать секрецию природного гормона роста, что может быть использовано в медицине. Цель - создание новых

151) 4 С 07 К 7/10 //Л 61 К 37/02

2 более активных пептидов. Их синтез ведут иэ Вос-Arg(Tos) или Вос-D-Arg(Tos), который связывают с полимерной смолой NBHA или ИЕАИ с последующим отщеплением Еос-защитной группы. Затем проводят постепенное наращивание пептидной цепи в последовательности, укаэанной в ф-ле (I). Полученный пептидилполимер общей ф-лы (II): Х,-R, (Х или Хг)-Г -Авр(Хэ)-Ala-Пе-Phe-Thr(X4)-R<(X4 или Х )-Ser(X<)-R® (Хг)-Arg(Xs)-R<< (Хв па

Хт)-R>> -Рщ -Cly-Сlп(Х ) Leu-R® (Х )-Ala-Arg(X< ) -Lys (X ) -Leu-1.еи-F,«(Х или Х )-R s(X>)-Пе-?11е-Rгв (X4 или

Х )-Р (Хд)-Х, где Х - тоэил, Х

Вос; Х вЂ” 2,6-дихлорбензил, X>0Bzl-, Х4 — бензиловый эфир, Х ксантил, Х вЂ” тозил, Хт — 2-хлорбенэилоксикарбонил, Х - смола-носитель

MBHA или NEAN, подвергают деблокированию и отщеплению пептида от смолыносителя с использованием фтористого водорода в сочетании с аниэолом или метилэтилсульфидом, или их смесью в качестве акцептора при температуре от 0 до (-20)ОС с последующим растворением полученного продукта в уксусной кислоте и очисткой, например, тонким фильтрованием через гель сефадекс G-50. Новые пептиды оказывают влияние на секрецию гипофизарных желез, что можно использовать для промотирования роста животных или в диагностической практике. 1 табл.

30097 4

МеОН (дважды) 0,5

50

Время смешивания, „ 55 мин

DCC1

ВОС вЂ” аминокислота

50-90

Изобретение относится к способу получения пептидов — новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.

Цель изобретения - способ получения новых соединений в ряду пептидов, малотоксичных и обладающих более высокой эффективностью в отношении стимулирования выделения гипофизом гормона роста.

Пример 1. Синтез пептида (D-NMA,Nle 3 -rGRF(1-29)-ИН имеющего следующую формулу: Н-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Пе-Leu-Пlу-Gln-Leu-Tyr-Ala-АгГ-I.ys-Leu-Leu-His-Glu-Il e-N1e-Asn-Arg-N_#_a i осуществляют последовательно с применением пептидного синтеэато" ра Бекман 990 на смоле МВНА, имеющей интервал замещения около 0,1-0,5 ммоль/г смолы. Связывание Вас-Arg(ToS) со смолой осуществляют обычным способом с использованием смеси хлористого метилена и

ДМФ при температуре около 60 С, в течение 24 ч при перемешивании с использованием 2 г смолы и 2 ммолей

Arg и получают замещение около

0,35 ммолей Arg на 1 г смолы.

После деблокирования и нейтрализации пептидная связь постепенно образуется на смоле. Деблокирование, нейтрализацию и прибавление каждой аминокислоты проводят обычным способом. Все растворители, которые применяют, тщательно дегазируют посредством продувки инертным газом, например, гелием или азотом.

Деблокирование предпочтительно проводят согласно режиму А:

Реагент Время смешивания, мин

603 TFA /2 этандитиол 10

60 TFA /2 Этандитиол 15

IPA /14 этандитиол 0,5

Et3N (103) в СН Сl 0,5

МеОН 0,5

Ft N (10 ) в СН С1а 0,5

МеОН (дважды) 0,5

СН Cl (дважды) 0,5

Сочетания предпочтительно проводили согласно режиму В:

Реагент

СН С1r (дважды) 0,5

АС О (3М) в СН Сl 15,0

СН Сl 0,5

МеОН 0,5

СН Cl (дважды) 0,5

В общем от 1 до 2 ммоль аминокислоты, защищенной ВОС, (трет-бутокси" карбонил), в хлористом метилене, ДМФ или их смеси, применяют на 1 г смолы плюс один эквивалент 1,0 моль DCC1 (N,N -дициклогексилкарбодиимида) в хлористом метилене в течение 2 ч.

При сочетании ВОС-Arg (ToS) применяют смесь 50ПМГ (диметилформамид) и хлористый метилен. Эфир BZ1 применяют как группу, защищающую гидроксил боковой цепи для защиты Яет(серин) и Thr (треонин), Амидогруппу Asn (аспарагин) или Gln (глютамин) защищают ксантилом (Xan), когда применяют предпочтительную связь DCC (N,N— дициклогексилкарбодиимид). Можно также применять P-нитрофениловый сложный эфир (01!р) для активирования концевой карбоксильной группы Аеп или Gln и, например, можно связывать

ВОС-Asn (ONp) e течение ночи, применяя один эквивалент НОВ в 503-ной смеси диметилформамида (DMF) и хлористого метилена, причем в этом случае DCC не добавляют, Для защиты Ьув (лизин) с боковой цепью применяют

2-хлор-бензилоксикарбонмл-(2С1-Z)Тов применяют для защиты гуанидиновой группы Атр и имидазольный азот Ндв, карбоксильную группу s боковой цепи

Gln или Asp защищают OBZ1. Фенольную гидроксильную группу защищает 2,6-дихлорбенэил (DCB), В конце синтеза по. лучают следующий состав: Boc-His-D-NMA-Asp(Хq)-Ala-Ile-Phe-Thr(X )- .

-Ser(X@)-Ser(X4.)-Tyr(X@)-Arg(X@)-Arg(X4)-Ile Leu-Сlу-61п(Ху) Leu-Tyr(Хт)-Ala-Arg(Х4)-Lys(Хт)-Leu Leu-Нis-Gln(Х )-Ilå-Nle-Asn(Xg)-Arg(X4)МВНА, где Х вЂ” DCB (2,6 где X — DCB (2,6-дихлорбенэил), Х вЂ” OBZ1

Х вЂ” BZ (дибензиловый эфир), Х вЂ” Хап, Хб — ТоЯ;

Х, — 2cl-z.

Хап (ксантил) можно частично или полностью удалять посредством обработки с TFA, применяемой для деблокирования группы защиты o(, -аминокислоты, 5 15

Для отделения и снятия защиты с защищенного пептида на смоле его обрабатывают 1,5 мл аниэола, 0,5 мл метилэтилсульфида и 15 мл фтористого водорода на 1 r пептида-смолы при

0еС в течение 30 мин ° После удаления фтористого водорода в условиях высокого вакуума остаток из смолы и пептида попеременно промывают сухим диэтиловым эфиром и хлороформом и затем пептид извлекают с помощью дегаэированной 2 н, водной уксусной кислоты и отделяют от смолы путем фильтрования °

После этого отделенный пептид, освобожденный от защиты, растворяют в 0-54-ной уксусной кислоте и подвергают очистке, которая может включать тонкое фильтрование через гель сефадекс с-50.

Затем пептид дальше очищают посредством препаративной или полупрепаративной НРЬС. Патроны, снабженные составом ЬС-500 фирмы Уотера Рссосиэйтз, набивают 15-20 мг кремнеземом С„ от Vydac (300Л). Градиент

CH CN в TEAP создается устройством низкого давления Eldex gradient maker Хроматографические фракции тщательно контролируют посредством EIPLC, причем собирают только фракции, показывающие значительную чистоту. Обессоливание очиц енных фракций, отдельно проведенных на чистоту, достигается .при применении градиента СН CN в 0,.14 TFA (трифторуксусной кислоте).

Затем вырезанную центральную часть лиофилизируют для получения требуемого пейтида чистотой свыше 984.

Получают 74,2 мг пептида, имеющего амидированный конец С цепи, с выходом около 54 от количества отщепленного пептида.

Пример 2. Синтез пептида (D-NMA,Ser,Nle j -rGRF(1- 29)-NEI имеющий формулу: Н-His-D-11ИА-Asp-Ala-Ile — Phe-Thr-Ser — Ser-Tyr-Arg-Arg,-Пе-Leu-Gly-Gln-I,eu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-G1n-I1е-I1le-Asn-Arg- ЛI<, проводят постепенно в синтезаторе

Бекман 990 на смоле ИВНА, аналогично примеру 1, При применении ТЬС с HPLC получают очень чистый пептид.

Пример 3. Синтез hGRF- — аналогового фрагмента 1 Э-11ИА,111е

-hGRF(1 — 29)-1 .Н<, имеющего формулу:

Н-Tyr-D- IIIA-Asp-Ala-Ilе-ГЬе-Thr-Asn-Ser-Туг-Arg-I.ys-Va1-Leu — Гlу-Гlп-Leu30097

-Ser-Al a-Arg-Ly s-I,eu-Ьeu-Г1л-А» р-11 e-Nl е-Ser-Arg-1Л1 проводят постепенно в синтезаторе для пептидов типа Бекман 990 на смоле МВНА согласно примеру 2, Применяя ТI.С (тонкослойную хроматографию) и EIPLC, устанавливают, что получают практически чистый пептид.

Пример 4. Синтез части аналога ЬСЕРф-MIA, Nle т, D-Arg j -hGFP (1-29)-ЛН, имеющего формулу:

Н-Tyr-D-1ЧИА-Asp-A14-П е-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Va1-Leu-Гl у-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu ln-Asp-Пе-Nle-Ser-D-ArI - PI проводят последовательно в синтезаторе Бекман 990 для синтеза пептида на смоле ИВНА аналогична примеру 1, При применении ТЬС и HPLC получают практически чистый пептид.

Пример 5. Синтез P D-Leu

14

Nl e 3 -rGRF(1-29) -1Л1, имеющего фор2т мулу:

Н-His-AI.a-Asp-Ala-Il е-Phe-Th r-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Il e-D-Leu-Сl у-С 1nв

-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-G1n- П е-Nl e-As n-Arg -NH < проводят последовательно в синтезаторе Бекман 990 для синтеза пептидов на смоле ИВНА, как в примере 1, При применении Т1.С и HPLC получают практически чистый пептид.

Пример 6. Синтез QD-NAIA, Nle 7,Asn 3 -hGRF-(1-29)-NHz, имеющего формулу:

Н-Tyr-D-ИИА-Asp-Ala-Пе-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Va1-Ьеи-С1у-Gln-Leu-Бег-Аlа-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asð-П е-Nl e-Asn-Arg-IIH < проводят последовательно в пептидном синтезаторе Бекман 990 на смоле ИВНА, как в примере 1. Пептид оценен как практически чистый, применяя TLC u

HPLС, Пример 7. Синтез ale

D-Arg Ъ -rGFZ(1-29) -%1, имеющего формулу:

Н-His-Ala-Asp — Аlа-Пе-Phe-Thr-Ser-Sег-Туr-Arg Àãg-11е-Leu-Clу-Гln-Leu-Tyr-Ala-Arg-I.ys-I,eu-1.eu-His-G1n-Il e-Nle-Psn-D-Агр-NEI< проводят постепенно в синтезаторе

Бекман 990 на смоле ИВНА, как в примере 1, По данным ТЬС и EIPLC, получается практически чистый пептид.

Пример 8. Синтез аналогового

ЬСВХ фрагмента (П-1Л1А,D-Tyr

Nle ") -hGRF(I-29)-ГЛ, имеющего формулу:

1530097

H- Ty r -D-? I? А-As p-Al a-I l e-Ph e- Th r-Asn-Ser-D-Tyr-Arg-1.у и ЧЬ1-Leu-Сlу-Gln-Leu-Ser-Ala-Àrg-Lyв-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-ИН

1 5 проводят. постепенно в синтезаторе

Бекман 990 на смоле ИВНА, как в примере 1. При применении Т1.С и НР1.С получают в основном чистый пептид.

Пример 9. Синтез аналогового

hGRF фрагмента PD-?1МА,Nle g -hGRF (1-29)-NHEt, имеющего следующую формулу:

Н-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-и е-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val Leu-Сlу-Сlп- 15

-Leu-Ser-Аlа-Arg-Lys Leu-Leu-Gln-Asp- Т1 е-N l e- S er-Arg-?П1СН СН g осуществляют последовательно в пептидном синтезаторе Бекман 990 на

N-алкиламиновой смоле, называемой также N-этиламинометиловой смолой (смолой NEAM) . Приблизительно 10 г

1 сшитой хлорметилированной поли стирольной смолы вводят в реакцию с

50 мл этиламина при температуре око- 25 о ло 4 С в течение приблизительно 36 ч при непрерывном перемешивании для замены хлорбензильных групп на N-этиламинобензильные группы и после завершения реакции несколько раз промывают метанолом и водой. Затем на первоначальной замещенной амидной связи синтезируют пептид. После получения нужной рептидной последовательности проводят снятие защиты и отщепление от смолы обработкой фтористоводородной кислотой с анизолом в качестве акцептора, проводя сначала пе о ремешивание.при 0 С, а затем оставляя смесь медленно нагреваться при .пере- 40 мешивании до комнатной температуры в течение приблизительно 3 ч, при этом пептид отщепляют от смолы в виде этиламида, По данным Т1.С и HPLC получают практически чистый пептид.

Пример 10. Синтез t D-ИИА, Nl е, Asn s) hGRF (1-29) -N}IEt имеющего следующую формулу:

Н-Туr-D-??МА-Asp-Alа-Ilе-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Сlу-С1п- 50

-Leu-Ser-Alа-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-?1НСН СН э проводят последовательно с использованием пептидного синтезатора Бекман

990 на смоле ??ЕЛМ аналогично приме- 55 ру 9. По данным TLC u HPLC этот аналоговый пептид является практически чистым.

Пример 11, Синтез аналогового PGRF фрагмента (His,D-ИИА,Nle 3 -hGRF(1-29)-NFI< имеющего следующую формулу:

Н-Hiв-D-?АВИА-Аер-А1а-Ile-Phe-Thr-Аап-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Сlу-С1а-Leu-Ser-Ala-Arg-I.ys-Leu-Leu-С1п-Авр-П е-Nl e-Ser-Arg-NFI и осуществляют последовательно с использованием пептидного синтезатора Бек" ман 990 на смоле ?ВНА аналогично примеру 1. По данным Т?.С и FIPLC пептид является практически чистым.

Результаты анализа приведены в таблице, Проведены биологические испытания синтетических пептидов, приготовленных в примерах.

Для сравнения использован искусственный человеческий фактор выделения гормона роста. В опытах in vitro обнаружено, что пептиды, полученные

;в условиях предлагаемого способа обладают в общем большей мощностью для секреции гормона роста (GH) и подоб ных присущих им активностей. Все эти искусственные пептиды рассматриваются как биологически активные и потенциально полезные для стимуляции выделения гормона роста через гипофиз.

При проведении испытаний применяли культуры, включающие клетки гипофиза крысы, удаленные 3-5 дней назад.

Такие культуры считаются оптимальными для секреции гормона роста и их применяют в сравнительном испытании, проводимом согласно способу Вейла.

Инкубационный период для испытываемого вещества составил 3-4 ч. Рликвоты культивируемой среды удалили и обрабатывали для измерения их содержимого в иммунореактивном гормоне роста

GH(ir GFI) способом радиоиммунологии.

Результаты сравнительного испытания для экоимомерйых концентраций показаны в таблице.

Испытания in vitro искусственных пептидов показывает, что многие из них обладают более высокой биологической силой, чем, например (в части мозга под зрительным бугром) hpGRF (1-40)-OH: минимальная эффективная концентрация, д-иэомер аланиназ, норлейцин -человеческий hGRF(1-29) аминогруппа составляет примерно 1 ммоль.

Помимо испытаний in vitro для секреций гормона роста искусственные пептиды вводили внутривенно крысам"

1530097 са мцан с ачес еэиоованием уретаном.

При этом ;скусственные пептиды подавляют самопроизвольную секрецию гормона роста беэ уничтожения реакции на наружный фактор выделения гормона

5 роста (СН). До инъекции спустя 10, 30 и 90 мин брали анализ крови. Уровни гормона роста (GEI) в крови, измеренные пробирочной радиоиммунологией, показали, что искусственный (P-изомер аланина, норлейцин 1-человеческий hGRF(1-29)-И!! примерно в 6 раз сильнее, чем человеческий hGRF(1-!!0)ОН в отношении уровней в крови гормона роста, выделяемого гипофизом, при измерении через 10 и 30 мин после 14-й инъекции. Для подтверждения этих результатов применяли другие известные испытания in vitro фактора выделения гормона роста (СРХ), которые эффек20 тивны в определении секреции гормона роста. Считают, что дозы примерно

50 нг и примерно 5 мг этих пептидов на 1 кг веса тела являются эффективными, чтобы вызвать секрецию гормона роста.

Некоторые пептиды, которые обладают равной или даже слегка меньшей биологической силой в испытаниях in vitro, чем стандарт, в жизни имеют значительно большую силу.

Такие искусственные аналоги человеческого hGFF p o Ho o GRF, бычьего и поросячего аналогов (в upCRF) могут быть отнесены к категории малотоксичных соединений.

Таким образом, проведенные биоло" гические испытания показали, что пептиды, полученные в условиях предлагаемого способа, малотоксичны и облада- 4

40 ют более высокой эффективностью в отношении стимулирования выделения гормона роста гипофизом в сравнении с синтетическим человеческим фактором выделения гормона роста hGFF(1-40)OH. 45

Кроме того, получаемые данным способом пептиды имеют более короткую цепь (29 аминокислотных остатков), что значительно упрощает их получение, 50

Формула изобретения

Способ получения пептидов общей формулы I

R -R -Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R -Serй Ь

-В1О -Агр,-R<<-Г,в-R « -С1у-Gln- ео-R«-Ala-Arg "Lys-Leu-Leu-F, -Р -Г. -Nl e"L4 "C5 Я; йв 9 где R< — Tyi, FIis;

R — Ala, 0ИИА;

К вЂ” Ser, Asn;

К1в — Туг, ЭТуг;

R<< — Arg, Lys;

К -Т1, Val;

К!4 — DLeu, Leu;, 1,в — Tyr, Rä4 — Н1в, Сlп;

Asp;

В. 6 — 1 1 е;

К в — Asn, Ser;

R,9 - Arg, DArg; т — ИН, NHC FI, при условии, что или R — МР!А, или R,4 — DLeu, или Ед

DArg, отличающийся тем, что

Boc Arg(Tos) или Вос D Arg(Tos) связывают с полимерной смолой 1БНА или

NEDM, Вос-защитную группу отщепляют и затем строят пептидную цепь, постепенно присоединяя аминокислотные остатки в последовательности, обусловленной формулой I, полученный при этом пептидилполимер общей формулы II

Х -R<(X или Х )-F -Аяр(Хв)-А1в-Ile-Phe-Thr(X4)-ГЭ-(Х4 или Х )-Бег(Х4) -R«> (Х ) -Агд (Х6) -Fn. (Хв или Хт)-R» -Г >4-Сlу-Сln(X )-Leu-R1> (Х ) -Аlа-Arg (X >) -Ьу s (Хт) -Leu-Leu-R <4(X или Х ) -+< (Х >) -Il e-I!l e-Г 26(Х4 ил Х )-К (F.s)-Х где Х вЂ” тозил, Х = Вос;

Х вЂ” 2,6-дихлорбензил, Х вЂ” ОВК1, Х4 — бензиловый эфир, Х вЂ” ксантил, Х 6 Tos++

X7 — 2-С1-бенэилоксикарбонил, Х вЂ” смола-носитель Г БНА или IJEAJI, деблокируют и отцепляют пептид от смолы-носителя и/или с использованием фтористого водорода в сочетании с анизолом или метил-этилсульфидом или их смесью в качестве акцептора при температуре от 0 до -20 С, полученный продукт растворяют в уксусной кислоте и очищают.

1530097

I

1 л с 1

1с л Э с л

Э *

X Ф

Z C

tU Э а ь сэ Z

1 I 1

1 1 Е С

Э Э с

X >X

Х 2

О T

1 1

1 1 С

1 I Э

I Ф I C

1 Э 1 1 1

1 1- I 5 х с

X 0ct

ы a X о 11

I а

1 1 Ф

1 1 С

О

I I о

1 1

I 1о сто! U С T

I X Ф Э Ф

r Z % Y

1 О Ф О а

Z С О

X>X Xe зал

1 Z C l6

1 1

1 О 1

1 О X а>"

1 C е. Ю

wn э О- а

1 X C

1 Z

1 Э X X

1 Б 0 X

1 Ф О II аощ

1 О Y С>! О

1

Э с

1 Т О а

1 CC II 0 X

1 2 10

C ! О Х

1 X

1

1

1

1

1

1

1 !

1

1

I

I

1 !

1 !

1 (1 X

1 II C ! Э !

1 !

1 !

1!

I I

U 1

X 1

Y с 1

tg 1 !

>с а 1

Ф I

Х 1

О I

C0 I

О I- I

Y О 1 с

1

I

I !

ДФ

1

1 ! !

I !

1

1

1

1

1

I

1

1

1

1

I ! !

I

1 !

1

1 !

1 !

1

1 и

tt>

Э и

> и н

o o

D О

-=с н

1 Ф

C о3 с> и о с;

C1вевлН I л>лв 1

У $ g „ I g a -„в $ 3 3 $, д > д> > >>„>е >\. 3 .>>->> — ->> — >>=>>.>> — ->в — > ° > > .! 1

СЧ М О W N СЧ A I М Л М 1 СЧ C & Л 1 л л ° л a a ° в а л е. а в

COCO ñ×-О W Лm СЛсЧLOЛО Ю

ЮЛСЧСЧЛЛ! « М NOO M е 1

I

) I

CV О и Л СЧ СЧ О О Q О> МСО M СЧ ф л е с л а а ° с с !

NLO М» ММСЧ LALAСЧ МММC NCV 1

1

LA LA LA LA LA Ln LA LA 1 с л

СЧ N СЧ ° ° СЧ С >! СЧ е- СЧ CV СЧ СЧ M > I

1

1

1 1 1 1 I I 1 1 1 I I 1 I

tg, I с=а 1 > 1 1 1 1 ! ! (I 1 1

I!

1

cnсо с> N N A лco Ln сч Мсо м cn LA <л

° а ° л в ° ° л О лсчсч -Mwnлw&счLo о! 1

LnLnLALnLnLnLnслLALALnЮLnNLALALA 1

1 1 ! 1 ! I I 1 I 1 1 ) 1 1 1

1

1!

ОООООООООООООООО I

М Ln М СЧ СЧ Co C> Л CO >.О MV mal е- -Г СЧ 1 м Ln МО\сч LA СЧ СЧ N e-CO 1

1 ° 1 е> 1

1 1 ч4 I

°

1 сЧ 1 с! с > I 1 4 t4 1

Б Б K е к хр

1 О1О CD - О О I I

СЧ С4 1» 1 N СЧ 1 с 1

Оi 4 I I I I !- СЧ!

4 <АСЧ ХЯ >.>»- -> — !МCA - -О> М 1

Й с!1

>>.> О > О 1 .- (С) 1-> - С ) Са Й (>> 1

cncn cn Ir сч сч m.c r. 4 !>,1= и !* Ф 1 сч сч сЧ Г.Э 1 1 сч 1 1 1 с4 Ы 1 1-> g CO Q 1 а eu un!a

I н л.1= . I ñ. I I 1,, Г (Г. (. C Н> Н И + е-4 е>, 4 Ю е> + C !

u> I н -! age - Curn

I !, а -Й е,!т 4 ф е> ct t- Н»» 4 а ф», с> се с4 се Э С>у> WCt Е е Й9 м ь с> 1

ЭЪЭe LЭНЭЙ - I НЭЯЭ еC 1 W 1 Н а Э Ле-! 1 яка "-1 кака к -икки I