Способ получения пептидов

 

ИЗОБРЕТЕНИЕ КАСАЕТСЯ ПЕПТИДОВ , В ЧАСТНОСТИ, СОЕДИНЕНИЙ ОБЩЕЙ Ф-ЛЫ H-R<SB POS="POST">1</SB>-ALA-ASP-ALA-JLE-PHE-THR-R<SB POS="POST">8</SB>-SER-R<SB POS="POST">10</SB>-ARG-R<SB POS="POST">12</SB>-R<SB POS="POST">13</SB>-LEU-R<SB POS="POST">15</SB>-GLN-LEU-R<SB POS="POST">18</SB>-ALA-ARG-LYS-LEU-LEU-R<SB POS="POST">24</SB>-R<SB POS="POST">25</SB>-JLE-R<SB POS="POST">27</SB>-W-Y, ГДЕ W = А)-ASN-ARG

@ Б)-ASN-ARG-GLN-GLN-GLU-

@ В)-ASN-ARG-GLN-GLN-GLY-GLU-ARG-ASN-GLN-GLU-GLN-ARG-SER-ARG-PHE-ASN-VAL-

@ Г)ASH-ARG-GLN-GLU-GLY-GLU-ARG-ASN-GLN-GLU-GLN-ARG-SER-ARG-PHE-ASH-

@ Y=OH

@ NH<SB POS="POST">2</SB>, R<SB POS="POST">1</SB>=TYR, D-TYR, HIS

@ R<SB POS="POST">8</SB>=SER

@ R<SB POS="POST">10</SB>=TYR

@ D-TYR

@ R<SB POS="POST">12</SB>=ARG

@ R<SB POS="POST">13</SB>=JLE

@ R<SB POS="POST">15</SB>=GLY

@ R<SB POS="POST">18</SB>=TYR

@ R<SB POS="POST">24</SB>=HIS

@ R<SB POS="POST">25</SB>=GLU

@ R<SB POS="POST">27</SB>=NLE, JLE, D-MET, MET, VAL, КОТОРЫЕ ОБЛАДАЮТ СПОСОБНОСТЬЮ ВЫЗЫВАТЬ СЕКРЕЦИЮ ПРИРОДНОГО ГОРМОНА РОСТА, ЧТО МОЖЕТ БЫТЬ ИСПОЛЬЗОВАНО В МЕДИЦИНЕ. ЦЕЛЬ - СОЗДАНИЕ НОВЫХ МАЛОТОКСИЧНЫХ И АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ. ИХ СИНТЕЗ ВЕДУТ СВЯЗЫВАНИЕМ С-КОНЕЧНОЙ АМИНОКИСЛОТЫ С ПОЛИМЕРОМ-НОСИТЕЛЕМ МБГА ИЛИ ХЛОРМЕТИЛИРОВАННОЙ СМОЛОЙ С ПОСЛЕДУЮЩИМ ОТЩЕПЛЕНИЕМ АМИНОЗАЩИТНОЙ ГРУППЫ И ПОСТЕПЕННЫМ НАРАЩИВАНИЕМ ПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ В СООТВЕТСТВИИ С ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ, УКАЗАННОЙ В Ф-ЛЕ, ДО ОБРАЗОВАНИЯ ПЕПТИДИЛПОЛИМЕРА ОБЩЕЙ Ф-ЛЫ X<SB POS="POST">1</SB>-R<SB POS="POST">1</SB>(X<SB POS="POST">2</SB>)-ALA-ASP(X<SB POS="POST">3</SB>)-JLE-PHE-THR(X<SB POS="POST">4</SB>)-R<SB POS="POST">8</SB>(X<SB POS="POST">4</SB>)-SER(X<SB POS="POST">4</SB>)-R<SB POS="POST">10</SB>(X<SB POS="POST">2</SB>)-ARG(X<SB POS="POST">5</SB>)-R<SB POS="POST">12</SB>(X<SB POS="POST">6</SB>)-R<SB POS="POST">13</SB>-LEU-R<SB POS="POST">15</SB>-GLN(X<SB POS="POST">5</SB>)-LEU-R<SB POS="POST">18</SB>(X<SB POS="POST">2</SB>)-ALA-ARG(X<SB POS="POST">6</SB>)-LYS(X<SB POS="POST">7</SB>)-LEU-LEU-R<SB POS="POST">24</SB>(X<SB POS="POST">5</SB>)-R<SB POS="POST">25</SB>(X<SB POS="POST">8</SB>)-JLE-R<SB POS="POST">27</SB>-W(X<SB POS="POST">8</SB>), ГДЕХ<SB POS="POST">1</SB>= ВОС

@ Х<SB POS="POST">2</SB> = ДИХЛОРБЕНЗИЛ

@ Х<SB POS="POST">3</SB> = OB<SB POS="POST">Z</SB>L

@ X<SB POS="POST">4</SB> = B<SB POS="POST">Z</SB>L

@ Х<SB POS="POST">5</SB> = КСАНТИЛ

@ Х<SB POS="POST">6</SB> = ТОЗИЛ

@ Х<SB POS="POST">7</SB> = 2-ХЛОРБЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ, Х<SB POS="POST">8</SB> = СМОЛА-НОСИТЕЛЬ

@ W = А) -ASN-ARG(X<SB POS="POST">6</SB>)

@ Б)-ASN-ARG(X<SB POS="POST">6</SB>)-GLN(X<SB POS="POST">5</SB>)-GLN(X<SB POS="POST">5</SB>)-GLY-

@ В)-ASN-ARG(X<SB POS="POST">6</SB>)-GLN(X<SB POS="POST">5</SB>)-GLN(X<SB POS="POST">5</SB>)-GLY-GLU(X<SB POS="POST">3</SB>)-ARG(X<SB POS="POST">6</SB>)-ASN-GLN(X<SB POS="POST">5</SB>)-GLU(X<SB POS="POST">3</SB>)-GLN(X<SB POS="POST">5</SB>)-ARG(X<SB POS="POST">6</SB>)-SER(X<SB POS="POST">4</SB>)-ARG(X<SB POS="POST">6</SB>)-PHE-ASN-VAL-

@ Г)-ASN-ARG(X<SB POS="POST">6</SB>)-GLN(X<SB POS="POST">5</SB>)-GLN(X<SB POS="POST">5</SB>)-GLY-GLU(X<SB POS="POST">3</SB>)-ARG(X<SB POS="POST">6</SB>)-ASN-GLN(X<SB POS="POST">5</SB>)-GLU(X<SB POS="POST">3</SB>)-GLN(X<SB POS="POST">5</SB>)-ARG(X<SB POS="POST">6</SB>)-SER(X<SB POS="POST">4</SB>)-ARG(X<SB POS="POST">6</SB>)-PHE-ASN-. ДАЛЕЕ ПОЛУЧЕННЫЙ ПЕПТИДИЛ-ПОЛИМЕР ДЕБЛОКИРУЮТ И ОТЩЕПЛЯЮТ ПОЛИМЕР-НОСИТЕЛЬ. НОВЫЕ ВЕЩЕСТВА ОКАЗЫВАЮТ ВЛИЯНИЕ НА СЕКРЕЦИЮ ГИПОФИЗНЫХ ЖЕЛЕЗ, ЧТО МОЖНО ИСПОЛЬЗОВАТЬ В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ И ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЦЕЛЕЙ. 2 ТАБЛ.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К flATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21 ) 3692330/23-04 (22) 12.01 .84 (3l) 488748 (32) 26.04.83 (33} US (46) 30.04.89. Бюл. 11 16 (71) Дзе Салк Институт фор Биолоджикал стадиз (VS) (72) Жан Эдуард Фредерик Ривьер (СН)

Вили Васке р Вэйл — младший (US) и Иохим Шписс (ЭЕ) (53) 547 . 964 . 4 . 07 (088 . 8) (56) Шредер Э., Любке К., Пептиды.

Ч. 1, М. Мир, 1967, с. 116, 398.

< 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ (57) Изобретение касается пептидов, в частности соединений общей ф-лы

Н вЂ” К-Ala-Asp †A-Ile-Phe-Thr-Rg-Ser1

-Rþ -Arg-R< -Rë -Leu-R, Ñ1n-Leu-Re—

-Ala-Arg-Lys — Leu Leu-К1 -R, Ile-R l—

-WY, где W = а) — Asn-Arg, б) — Asn-Arg G1п-Сlп-Glu —,в) -Asn-Arg-Сlп-Сlп-С l y-G lu-Arg -AsnG 1n-Glu -G ln Arg -Ser

-Arg-Phe-Asn Val, г) Asn-Ага-С *1п-Glu-Сlу-С1ц Агд Asn-С1п-С1п-Сln-Arg-Ser-Arg Phe-Asn-, Y = ОН, NH, R = Tyr, D-Tyr, His, Rq = Ser, Кщ= Tyr, D-Tyr,R<=

Arg R > = ? 1е R = Cly; .Rùs = Tyr

D et, Met, Ual, которые обладают способностью вызывать секрецию природного гормона роста, что может быть использовано в медицине. Цель — созда„„Я0„„1477248 А3

I51I 4 С 07 К 7/1О//А 61 К 37/02 ние новых малотоксичных и активных пептидов. Их синтез ведут связыванием С-конечной аминокислоты с полимером — носителем МБГА или хлорметилированной смолой с последующим отщепле-нием аминозащитной группы и постепенным наращиванием пептидной цепи в соответствии с последовательностью, указанной в ф-ле, до образования пеп— тидил-полимера общей формулы Х,R (Х )-Ala-Азр(Х,) — Ile-Phe-ТЬг(Х,,) -К„(Х )—

-Ser (X+) -К, (Х )-Arg(X +) -R «(X6) -R, -I eu-R, . -< 1п(Х ) -Leu — R (Х ) -Аlа-Arg (Xq) -Lys(X> ) -Leu-Leu-R (Х )—

К (Хз) Ile R ò W(X8) где X, — Boc;

Х вЂ” дихлорбензил, Х вЂ” ОВ-1; Х q

В 1, Х „— ксантил, Хб — тозил; Х

2-хлорбензилоксикарбонил; Х вЂ” смоланоситель, W = а) -Asn-Arg(X6), б) — Asn-Arg (X ) -Сlп(Х,) -С1п(Х )—

-Сlу-, в) — Asn-Arg (X6) -Сlп(Х )—

-Сlп(Х ) -Gly-Glu (Х,) -Arg (Х6) -Asn-С1п(Х ) -С1и (Х ) С1п(Х ) -Arg{Õ )—

-Ser (X ) -Arg (Х ) -Phe-Asn Vair) — Asn Arg(Х ) -Сlп(Х ) -С1п(Х ) -СlуW lu (Х > ) -Ar g (Х ) -А зп-С l и (Х ) -С1и (Х )-Сlп (Х ) -Arg (Xs) -Ser (Х ) -Arg (Õ ) -Phe-Asn-. Далее полученный пептидил полимер деблокируют и отщепляют полимер-носитель. Новые вещества оказывают влияние на секрецию гипофизных желез, что можно использовать в сельском хозяйстве и для диагностических целей, 2 табл.! >7 7248

Деблокирование и редпочтительно проводят в соответствии в соответ— ствии со схемой А:

Реагент

Время. 45 смешивания, мин

1 . 607. TFA/27 тандитиол

2.607. TFA/27 этандитиол 1

3 . IPA/1 7 э тапдит пол

4.EtIN() 07) в СН С1

5.МеОН

6ЕТ 1)(! 0!) в СН Сl

7 .МеЙН (дважды)

8 . СН, С l (,Ra»T<, »t)

Связывание llредпоч t >t>ельно по схеме V» .

50

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5 проводят

Изобрс те ltll<» >н»с игс я v. < п«.<.»бу получения I><.T:òttä<î>< — нс вьтх биологически акт>IR>tht< с»сдинений, которые могут найти I>pit>IE ><ение в меди»ине и

5 ветеринарии.

Цель изобретения — получение химическим путем новых пептидов, способствующих выдс пению гормона роста гипофизом, — более активных и мало- 10 токсичных соединений.

Пример 1 Синтез гЬ СКЕ ()-43) имеющего формулу H His-Ala-Asp-Аlа-Ile-Phe-Thr-Ser-$ег-Tyr Arg-Arg-Ile — Leu-G1ó-С1тт — Leu-Tyr †A-Arg- 15

-Lys-Leu-Leu-His-Glu — Ile — D-Met -Asn-Arg — Сlu-С1п-Сlу — Glu — Arg-Авп-Сlп-Glu-

-С1с>-,ln — Arg — Ser-Arg-Phe-Asn-OH, проводят ступенчато с применением пеп— тидо-синтезатора модели "Бекман-990" 20 на хлорметилированной смоле, имею— щей интервал замещения 0,!в

0,5ммоль/г смолы. Связывание ВОС-Asn (Xan) со смолой осуществляют по общей о методике, используя KF в ДМФА при 60 С 25 в течение 24 ч при перемептивании.

Это ведет к замещению 0,35 ммоль

Asn на 1 r смолы.

После деблокировки и нейтрализации пептидную цепь ступенчато нара- 30 щивают на смоле. Деблокирование, нейтрализацию и добавление каждой аминокислоты осуществляют в общем соответствии с методикой. Все используемые растворители тшательно 35 дегазируют пробулькиванием инертного газа, например гелия или азота, чтобы обеспечить отсутствие кислорода, который мог бы нежелательным. образом окислить серу остатка Met; 40

Время смеРe" aãe>I I. шивания, мин

9.DCCI, 1О.Вос-аминокислоты 50-90

) ) ЛеОН (дважды) 0,5

1 2 . СН Сl (дважды) 0,5

13.АС О (3H) в СН Сl. ) 5,0

) 4.CH Cl 0,5

1 5 .МеОН 0,5

16.СН С1 (дважды) 0,5

1-2 ммоль ВОС-защищенной аминокислоты в метиленхлориде исполь зуют на ) г смолы плюс один эквивалент

1,О-молярного DCC1 в метиленхлориде в течение 2 ч . При связывании ВОС—

-Arg(TOS) используют смесь 507 ДМФА в метиленхлориде. Bzl ýôèð используют в качестве защитной группы для гидроксильной боковой цепочки в случае Ser u Thr . Амидог руппу остатка

Asn или Gln защищают с помощью Хап при использовании ДСС-связывания в предпочтительном варианте, п-Нитрофениловый эфир (ONp) также может использоваться для активации карбоксильного конца остатка Авп или Gln, например, ВОС-Asn(ONp) может подвергаться связыванию в течение ночи с исполь зованием одного эквивалента

HOBt в 507 смеси ДМФА и метиленхлорида, в этом случае DCC не добавляют.

2-Хлорбензилоксикарбонил (2Cl-z) используют в качестве защитной группы для боковой цепочки Lys,, Tos а также для защиты гуанидиновой группы остатка Arg, а имидозольный азот остатка His, Glu или Asp-карбоксильную группу защищают в виде Bzl-эфира (OBz1) . Фенильную гидроксильную группу остатка Tyr защищают 2,6-дихлорбензолом DCB. В конце синтеза получают следующий состав: X -His(X)—

-Ala-Asp(Хз) -Ala-Пе-Phe-Thr-(Х4)—

-Ser (Х4) — Ser (X4) -Туг (Xz) -Arg (Хб)

-Arg(X>) -Ile-1,пе-С1у-С1п-(Х <) -Leu-Tyr-(Х ) -Ala Arg-(Õ<;) -Lys(X )-Leu—

-Leu-His(X) Wlu-(X )- Asn(X ) -Сlп(Х )-G lu (Х. ) -Gln (Х ) -Arg (Х ) -Ser (Х )—

-Ar g (Х 6 ) — Phe-А sn (Х ) -Х z, где Х вЂ” TOS, Х, — ВОС

Х вЂ” DCB, Х вЂ” ОВг1;

Х вЂ” Bzl;

Х,- — Xan;

Х вЂ” TOS;

Х, -2Clz

1477248

X — подложка на Основе — — СН и 7 смолы, Хап может быть частично или полнг— стью удален обработкой с помощью

TFA, используемой для i.åáëoêèðoâàния k -аминозащитной группы.

После связывания со смолой конеч— ного остатка Н1з ВОС удаляют с помощью 607 TFA в СН Сl . Для отщепления и удаления защиты с оставшегося защищенного пептида-смолы, его обра— батывают 1,5 мл анизола, 0,5 мл метилзтилсульфида и 5 мл фтористо— го водорода (HF) nа 1 г пептидао смолы при -20 С в течение получаса и при 0 С в течение получаса. После удаления НР в условиях вакуума оставшийся пептид-смолу промывают по очереди сухим диэтиловым эфиром и хлороформом, а затем пептид экстрагируют дегазированной 2н. водной уксусной кислотой и отделяют от смолы фильтрованием.

«Ile Met-Азп(Х ) -Arg (Х ) -Glu(Х -)

-Сlп(Х ) -Сlу-Glu(Х ) — Arg (Х )—

Расщепленный и лишенный защиты пептид растворяют в 0 †57 †уксус— ной кислоте и подвергают очистке, которая может включать тонкую гельфильтрацию на Сефадексе G-50.

Затем пептид очищают препаративной или полупрепаративный высокопроизводительной жидкостной хроматографией. Гильзы для LC — 500 фирмы

Waters Associates заполняют С„, кремнеземом 15-20 мкм, поставляемым фирмой Vydas (300A) . Градиент ацетонитрила (CH CN) в TEAP создают с помощью аппарата для получения градиента низкого давления фирмы

Eldex. Хроматог рафические фракции тщательно контролируют с помощью высокоэффективной . жидкостной хроматографии и объединяют только фракции, проявляющие достаточную ч истоту. Обессоливание оч ищенных фракций, независимо проверенных на чистоту, осуществляют, используя гради-, ент СН CN в 0,1Х-ной трифторуксусной кислоте. Затем диофилизируют центральный срез, чтобы получить нужный пептид, чистота которого составляет выше 98Х.

С помощью тонкослойной хромато— графии и высокоэффективной жидкостной хроматографии определяют, что пептид свободной кислоты является по существу чистым. Для всех очисток с помощью высокоэффективной жидкост5 ной хроматографии используют 5-микронную аналитическую колонку Чуdac Сщ . Пептид удаляют из колонки, используя смесь буфера А (0,17-ная водная трифторуксусная кислота) и буфера В (607, ацетонитрил в 0,17-ной водной трифторуксусной кислоте).При

51 об.7 буфера В пептид элюируется при 8,9 мл ° Оптическое вращение измеряют на фотоэлектрическом поляриметре. Оно составляет п = -52,4 +

+1 (С = 1, 17-ная уксусная кислота, не скорректировано) .

Синтез повторяют, используя смолу

МВНА, чтобы получить rh GRF (1 -43)-NH применяя методику, обычно используемую в данной области для связывания Asn к смоле МВНА. Определяют, что пептид является по существу чистым с помощью тонкослойной хромато25 графии и высокоэффективность жидкостной хроматографии. Оптическое вращение измеряют на фотоэлектрическом т поляриметре. Оно составляет !с4-1,,о — -52,2 +1 (C= 1, 17.-ная уксусная кислота, не скорректировано).

Пример 2. Синтез (Nle )rh

GRF (1 -32)-ИН, имеющего формулу

Н-His-Ala-Asp-Ala-Пе-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr Àrg-Arg — Пе-Leu-Сlу-Сlп-Leu-Tyr

-Ala-Ar g — Lys-Leu -Leu -Hi s-G lu -I1-åNl-Аsn ArgWlnWlп — Сlу — NH проводят ступенчатым образом, используя пептидный синтезатор "Бекман-990" на смоле МВНА (как в примере 1) . Оп—

4 ределяют, что этот аналог является по существу чистым с помощью тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии при элюирован::и из колонки высокоэффек45 тивного жидкостного хроматографа при

8,4 мл с 55Х-ным буфером В. Оптичео ское вращение составляет -55,8 +! (С = 1, 17-ная уксусная кис ота) .

П р и м e o 3. Синтез fD-Тут j-rh GRF (1-29)-NH» имеющего формулу

Н-0-Tyr-Ala-Asn-Аlа-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-D- Tyr-Arg Arg-Ile-1.ец-С1у-С1п— Leu - Tyr-A l a-Ar g -Ly s-Leu — Leu -H i s-G lu -I1е-Me t -Asn-Arg-NH

55 п ров одят ступенчатым образом, исп оль— зуя пептидный синтезатор "Бекман-990" на смоле МВНА (как в примере 1) . Определяют, что с помощью тонкослой14772 ной хроматографии и выгокопр >и подптельной жидкостной хром 1тnl рафии прп элюировании из колонки высокоэффек— тивного жипкостного хроматогр: фа при

9,0 мп с 61 -ным буфером В показывают, что пептид практически чистый. Оптичео ское вращение составляет -63,6 +1 (G = 1, 17.-ная уксусная кислота) .

П р им е р 4.Синтез (Tyr ) -rhGRF 1О (1-29-МН, имеющего формулу Н-Tyr-Ala-Аяр-Аlа-I lе-Phe-The-Ser-Ser-Tyr Àãg-Arg-I1е-Leu — С1у-С l у-Leu-Tyr-Al а-Arg-l,ys-Leu-Leu-G1n — Glu-I1е-Ме t-Asn-Arg-MH, провоДят ступенчатым образом,ис- 15 пользуя пептидный синтезатор "Бекман-990" (как в примере I ) .Определяют, что пептид является по существу чистым с помощью тонкослойной хроматографии и высокопроизводительной жидкостной 2О хроматографии при элюировании из колонки высокопроизводительного жидкостного хроматографа при 7,8 мл с

587.— ным буфером В. Оптическое вращение составляет -49,6 +I (С = 1, 25

) 7.-ная уксусная кислота) .

Пример 5. Синтез rh (1-43) -ОН формулы Н-His — Ala-Asp-Ala-Ile-Phe- Tbr-S e r -S e r — Tyr — Arg — Ar g -I l e-Leu-Сlу-Сlп-Leu — Tyr-Ala-Arg — Lys-Leu ЗΠ— Leu-His-Glu-lie Wet-Asn-Arg-GlnG l n-С 1 у-С l u-Ar g -Аяп-С 1п -С1и -С l n-Ar g

-Ser-Arg-Phe-Asn-OH проводят ступенчатым методом с использованием пептидного синтезатора "Бекман-990" на

35 хлорметилированной смоле, имеющей интервал замещения 0,1 -0,5 ммол/г смолы, по методике, описанной в примере 1.

При использовании ТСХ и ЖХВД пеп — 4О тид признан существенно чистым. Оптическое вращение измеряют на фотоэлектрическом поляриметре. Оно составляет $

Синтез повторяют с, использованием смолы МБГА для получения rh GRF (1-43) — МН . При этом в качестве исходной аминокислоты используют Asn.

При использовании TCX u ЖХВД пептид признан существенно чистым. Оптическое вращение измеряли на фото лектрическом поляриметре, оно составляет (

-NH >, имеющего формулу Н-His-Аlа-Asp48 6

-Ala-Tle-Phe-Thr-Ser-Ser-Туг-Arg-Arg-T le-1.eu — Gl у-С1п-1.eu-Tyr-Ala-Arg-1.y s-Leu -1.eu-Hi я-Сlп-I l å-Nl e-Asn-Ага-С1п-Gln&l y-NH проводят ступенчатым методом с использованием пептидного синтезатора "Бекман-990" на МБГА-смоле, как в примере 1 . При использовании ТСХ и ЖХВД аналог признан существенно ч истым.

Пример 7. Синтез фрагмента аналога hp GRF, т.е. $D-Tyr J -rh

GRF (1-29) -NH . имеющего формулу

Н-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-D-Tyr-Arg-Arg-I1e-Leu-С1уС1п-Leu-Tyr-Аlа-Аг@-Lуs-Leu-Leu-Нis—

-С1и-lie et-Asn-Arg-NH, проводят ступенчатым методом с использованием пептидного синтезатора "Бекман-990" на МБГА-смоле (как в примере 1) .При использовании ТСХ и ЖХВД пвптид признан существенно чистым.

Синтез повторяют с замещением

D-Tyr вместо His íà N-конце с получением (О-Tyr " 3 -rh GRF (1 -29) -МН .

П р им е р 8.Синтез tNle j-гЬ

GRF (1 -32) -МН, имеющего формулу

Н-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-

-Бег-Tyr Arg-Arg-Ile-Leu-Сlу-С1п1.eu-Tyr-Аlа-Arg-Lys-Leu-Leu-Ндя-С1и-Ile-Nle-Аяп-Агя-Сlп-Сlп-Сlу NH, проводят ступенчато с использованием пептидного синтезатора "Бекман-990" на МБГА-смоле (как в примере 1)

При использовании TCX и ЖХВД пептид признан существенно чистым. Оптическое вращение измерялось на фотоэлектрическом поляриметре. Оно составляет (. = -52,6 +1 (С = 1, I 7-ная уксусная. кислота, не скорректировано)

Пример .9. Синтез rh GRF- Ча1" -NH Д, имеющего формулу H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Агg — Пе-Leu-Сlу-Сlп-Leu—

-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Hiя-С1и-Пе -+1еt-Аsn-Arg-Сlп-С1п-СlуСlu — Arg—

-Аяп-Сlп-Glu-Сlп-Arg-Ser Arg-PheAsn Va1-МН, проводят ступенчатым методом с использованием пептидного синтезатора "Бекман-990" на МБГАсмоле (как в примере 1) . При использовании ТСХ и ЖХВД пептид,.признан существенно чистым. Вращение плоскости поляризации света составляет о

-50,8 (С = 1, I 7-ная уксусная кис-, лота), разделения с использованием жидкостной хроматог рафии высокого разрешения проведено при аналогич—! 77 ных условиях, изложенных ранее, и с использованием 53/-ного буфера В, объем удержания 7,2 мл.

Проведены биологические испытания.

Полученные в различных примерах сравнивают с очищенным синтетическим

hp GRF (1-40) -ОН или очищенным синтетическим hp GRF (1-40) Phe ln-ИН в ходе анализов in vitro для определения их эффективности стимулирования выделения гормона роста (ГР) .

При непос.редственном сравнении используют эквимолярные концентрации различных синтезированных аналогов. Используют культуры, которые включают клетки гипофиза крыс, удаленных предварительно на 4 — 5 сут. Куль— туры, которые считаются оптимальны— ми для выделения гормонов роста, ис- 20 поль зуют для сопоставительного испытания. Инкубирование с подлежащим испытанию веществом проводят в течение 3-4 ч, и аликвотные количества культуральной среды удаляют и обра — 25 батыиают для измерения их состава по иммунореактивному ГР (ир-ГР) с помопью оадиоиммуноанализа хорошего разрешения.

Результаты сопоставительных испы — 30 таний с использованием эквимолярных концентраций приведены в табл. 1 .

Испытание этих синтетических пеп— титов in vitro показывает, что ЕС,О колеблется в диапазоне 20-1 00 пмоль, а низшая действующая концентрация составляет 3 — 8 пмоль . Максимальная действующая концентрация для ph GRF (! -40) NH составляет 1 нмоль .

Результаты сопоставительного ис40 пытания для эквимолярных концентраций различных hp GRF-аналогов, основанных на rh GRF, приведены в табл.2.

В доп олн ение к исп ытан иям in ч i tr o секреции гормона роста проводят так- 45 же эксперименты in vivo: вводят синтетический пептид через постоянный катетер свободно движущимся нормаль— ным крысам-самцам. Животных предварительно обрабатывают с помощью

FLA-63, инг иб ито ром доп амин-г идрокси50 лазы, который подавляет самопроизвольную секрецию гормона роста, не влияя на реак..m» а экзогенный GRF .

Пробы крови отбирают через тот же

55 катетер непосредственно перед инъек— пиями и спустя 5 и 20 мин после них, методом радиоиммунного анализа измеряют уровни содержания гормон"-. роста в крови, Результаты показывают, что синтетические hp GRF-аналоги являютс я мощными стимул ято рами секреции гормона роста гипофиза. Дозировка 20 — 25 мкг на кг массы тела сочтена эффективной. Соединения относятся к категории малотоксичных.

Формула изобретения

Способ получения пептидов общей формулы

Н-R -Ala-Asp-Аlа-Пе-Phe-Thr-R -Ser-! в

Кю Агд — К, -К,з -Leu — R«Win-Leu-R,<—

-Ala — Arg — 1.ys-Leu — 1,ец-К -R -I le-КД7-WY, где W: — Asn-Arg, -Азп-Arg Ñln-Сlп-Сlу

-Asn-ArgWlnWlnWlyWlu Arg-A sn — G l n-G lu -С l и -Ar g-Ser -Arg-Phe-Asn Val;

-Авп-Arg W In InWlyWIu-Arg-Asn — Сlп-С1и E ln-Arg Sår-Агд-Phe-Asn-, y = Онт NH2, R, = Tyr, D-Tyr, Нis, R< = Ser, R, = Tyr, D Tyr, R, = Arg, R, = Ile;

С 1 у

R!,в= Tyr;

R Hrs, 25

К = Nl.å, Ile, Р-Иег., Met, Val, отличающийся тем, что соответствующую С-конечную аминокислоту связывают с полимером — носителем МБГА или хлорметилированной смолой, аминозашитнчю группу отщеп— ляют и проводят постепенное наращивание пептидной цепи в соответствии с целевым пептидом до образования пептидил-полимера общей формулы

Вос; дихлорбензил, ОВ 1;

Вгl ксантил; где Х

Х, Х!

Х тозил;

Х, -R, (Х ) — Ala-Asp (X >) -Ile-Phe-Thr (Хд)-К (Х,) -Ser (Х4) К „(Х ) -Arg (Х )—

Кqg (Xg) К,з -Leu-R -Сlп(Х ) -LeuK,в (Х, ) -Ala-Arg (Xq) -Lys(Xò) -Leu

Кт4 (Xs) R (X ) Ile Rqq W(Xs) ! ()

-Arg (X 6) -Ser (Х ) -Arg (Х )—

-Phe-Asn-Val, -Asn-Arg (X ) -Сlп(Х ) -Сlп(Х .)—

-С1у-С1ы (X ) -Arg (X6) -Asn-C l и (X ) -С lu (Х ) -С l n (Х z)

-Ar g (Х ) -Ser (Х ) -Arg (Х )—

-Phe-Asn и полученный пептид-полимер деблокируют и отщепляют полимер-носитель.

1477248

Таблица 1

Относительная активность предлагаемых соединений

Относительная а к тив нос ть

Пептид (Nle J -rh GRF (1 32)-NH 3.21 (2.02-5.43)

2. )His 3-rh GRF (1-32)-NH< 2.15(l 12-4,41)

3. (Н1в, Nle j -rh GRF (1-32) -NH 3. 22 (2.12-5.33) Таблица 2

Сравнительная активность соединений, полученных в условиях предлагаемого способа, с активностью hp GRF (1-40)-ОН принятой за I OOX

Сравнение, Х

Пептид

hp GRF (1-40) -ОН (стандарт) (Nle ) -rh GRF (1-29) -NH, (Р-Tyr "0 J -rh GRF (1-29)-ИН

tTyr J -rh GRF (1-29)-NH

Г111е 1 -rh GRF (1 32) -NHz (Ееи, Nle j -rh GRF (1-29) -НН (И1е )- rh СИР (1-32) -ИН

tHis j — hp GRF (1-32) -NH (His, Nle 1- hp GRF (1-32)-ИН

rh GRF (1-43)-ОН

rh GRF tVal -NH

Составитель В. Волкова

Редактор М. Петрова Техред N.Äèäûê Корректор М, Пожо

Заказ 21 69/58 Тираж 339 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

Х вЂ” 2-хлорбензилоксикарбонил, r

Х „— смола-носитель; I

W: -Аsn-Arg (X ) —, — Asn Arg(X„) -Gln(X .) -С1п(Х )— 1y;

-Аsn-Arg(Х ) -Сlп(Х ) -Gln(X>-)—

-Сl у-С lu (X, ) -Arg (Х6) -А зп-Сlп(Х ) -Glu(Хз) -Сlп(Х )—

1 OOX

1 100Х

600Х

920Х

1390Х

480Х

321 Х

215Х

322Х

3ООХ

670Х