Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus - продуцент моноклонального антитела к вирусу карельской лихорадки

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и касается получения моноклональных антител. Штамм носит название "КАРЕЛ - 34" и депонирован под номером ВСКК(П) N 2279D. Продуцирует мон АТ, относящиеся к классу JDM. Продукция мон АТ сохраняется на протяжении 30 пассажей в культуре и 5 пассажей на мышах. Клетки "КАРЕЛ - 34" продуцируют в культуре моноклональные антитела в титрах 1:1000 в реакции непрямой иммунофлюоресценции. Введенные в брюшную полость мышей они индуцируют образование асцитной жидкости с высоким содержанием антител в реакции НФМА до 1:10000. Благодаря активной продукции антител клетки "КАРЕЛ - 34" могут быть использованы для приготовления диагностических препаратов. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР

1 (21) 4396850/31-13 (22) 04.03.88 (46) 30. 12.89. Бюл. Ф 48 (71) Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского (72) Л.В. Урываев, А.С. Новохатский, Т.Г. Михеева, Н.А. Парасюк, К.С, Ионова, Т.М. Шуткова, Т.М. Скворцова, Д.К. Львов и В.М. Жданов (53) 587.085.23(088.8) (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUSNUSCULUS — ПРОДУ-, ЦЕНТ МОНОКЛОНАПЬНОГО АНТИТЕЛА К ВИРУСУ КАРЕЛЬСКОЙ ЛИХОРАДКИ (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и касается .получения моноклональных антител. Штамм

Изобретение относится к гибридомной технологии и касается получения моноклональных антител.

Штамм получают следующим образом.

Мышиные миеломные клетки гибридизуют с клетками селезенки мьппей

BALB/с, иммунизированных вирусом карельской лихорадки штамм Leiv-9298.

Гибридные клоны культивируют на селективной среде ГАТ. С помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции выявляют клоны, продуцирующие моноклональные антитела к вирусу карельской лихорадки. Путем серийных пассажей клетки одного из . наиболее .продуктивных клонов "Карел-34" выводят в массовую культуру. Штамм

"Карел-34" депонирован под номером

„„SU„„1532582 А1

2 носит название "Карел-34" и депонирован под номером ВСКК(П) Р 2279D.

Продуцирует мон AT относящиеся к классу IgM. Продукция мон AT сохраняется на протяжении 30 пассажей в культуре и 5 пассажей на мышах. Клетки "Карел-34" продуцируют в культуре моноклональные антитела в титрах

1:1000 в реакции непрямой иммунофлюоресценции. Введенные в брюшную полость мьппей они индуцируют образование асцитной жидкости с высоким содержанием антител в реакции

НФМА до 1:10000. Благодаря активной продукции антител клетки "Карел-34" могут быть использованы для приготовления диагностических препаратов. 1 табл.

ВСКК(П) Р 227Р и характеризуется следующими культуральными признаками.

Среда для культивирования - ереда Дульбекко с 15Х-ной эмбриональной телячей сыворотки, пируватом натрия, 4,5 г/л глюкозы, 2 мМ глютамина, 5 х 10 М 2-меркаптоэтанола антибиотиком гентамицином

ЬО мкг/мл, 0,2 ед/мл инсулина 10 мм

ИЕРЕ$. Характер роста — стационарная суспензия. Метод снятия — встряхивание. Частота пассирования — чеpcs 2-4 .сут. Посевная доза - 150200 тыс. клеток в 1 мл среды роста.

Кратность рассева 1:3 — 1:5. Культура состоит из слабо прикрепленных к субстрату округлых клеток различ4

1532582, Образцы моноклональных ан тител

Титры антит ел с вир усами незараженные незагриппа (А/СССР /

/90/77) японосповенесукарельской лихорадки (Leiv

9298) раженные ского энцефалитa лошадей (клон 9) эльского энцефаломиеливакцины (штамм

Листер) клетки

ВНК-21 клетки кури— ных фибробластов та лошадей (штамм

ВЭЛ-230) 10

l0

10, 10

Карел КЖ №- 1 1280

КЖ ¹ 2 2560

КЖ № 3 5120

АЖ № 1 10000

АЖ №- 2 10000

АЖ № - 3 5120

ОЖ № 1 1280

10 и величины с ядрами, занимающими лысую часть клеток. Ядрышки круп е, встречаются двухъядерныеклетки. топлазма имеет вид тонкого ободка и смещена ядром к одной из стенок. льтивирование гибридомыв организме нотного: мыши BALB/ñ, доза клеток ри прививке (1-2) х 10 клеток, вотные предварительно сенсибилизиованы пристаном. Асцитная опухоль бразуется через 10-12 сут.

Специфичность и активность антиел: вирус карельской лихорадки, итр в РТГА 1:640000, РНИИФ 1:100000. онтаминация: бактерий нет, грибов дрожжей нет, микоплазмы нет, вируы — обнаружены частицы А и В, анаогичные частицам родственного штама клеток NSO.

Класс продуцируемых иммуноглобуинов: IgM.

Стабильность продукции антител: родуцируют моноклональные антитела а протяжении 30 пассажей в культуре

5 пассажей на мышах (срок наблюения).

Криоконсервирование: ростовая реда, 90% 3ТС, 10% DMSO. Условия ранения — жидкий азот. Жизнеспособость гибридных клеток после размоаживания 60-80%.

Пример. В культуральные матрасы объемом 250-500 мл засевают гибридные клетки "Карел-34" в концентрации 150-200 тыс./мл в среде Дульбекко с 15%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 4 г/л глюкозы, 2 мИ глютамина, 50 мкг/мл гентамицина. Культуры инкубируют при 37 С в стационарном состоянии 3-4 сут и используют как образцы культуральной жидкости. Осадок клеток ресуспендируют в 1 мл среды без сыворотки и вводят в брюшную полость мь шей

BALB/ñ. Через 10-12 сут образуется асцитная жидкость (опухоль), которую используют как образец аспитной жидкости после осаждения клеток.

Определение активности моноклональных антител, продуцируемых штаммом гибридных клеток "Карел-34" в серологических реакциях.

Образцы индуцированной гибридными клетками "Карел-34" асцитной жид кости и культуральной жидкости исследуют в реакции непрямой иммунафлюоресценции (НФМА) и реакции торможения гемагглютинации.

Результаты типовых опытов представлены в таблице.

Результаты показывают, что монокло25 нальные антитела "Карел-34" специфически реагируют с антигенами вируса карельской лихорадки и не взаимодействуют с вирусами осповакцины, венесуэльского энцефаломиелита лошадей, японского энцефалита, гриппа, а также антигенами незараженных клеток.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Musmusculus ВСКК(П)

- 227D — продуцент моноклонального антитела к вирусу карельской лихорадки.

1532582

Продолжение таблицы

Образцы моноклональньгх ан тител +

Титры антител с вирусами венесуэльского энцефаломиелияноноспокарельской лихорадки (Leiv

9298) незанезараженные гриппа (А/СССР/

/90/77) вакцины (штамм

Листер) ского энцефалита лошадей (клон 9) раженные клетки

ВНК-21 клетки та лошадей (штамм .

ВЭЛ-230) кури— ных фибробластов

Контроли:

ИАЖ к ВКЛ 512

АЖ гибридомы

ОКА, содержащая антитела к ви- русу осповакцины 10

ИАЖ к вирусу гриппа

А/СССР/90/70 10

ИАЖ к вирусу японского знцефаломи елита 10

10 10

10

10, 10 1280

10

10 10

10

10 1280

10 10

10 10,10

10

П р и м е ч а н и е: Титры антител даны в величинах, обратных разведениям сыворотки, использованным в НФМА. .М.

ИАЖ вЂ” иммунная асцитическая жидкость, ОЖ вЂ” отмывочная жидкость ВКЛ вЂ” вирус карельской лихорадки.

КЖ вЂ” культуральная жидкость, АЖ вЂ” асцитная жидкость.

Составитель А. Маныкин

Редактор Т. Лазоренко Техред Л.Сердюкова Корректор Э. Лончакова

Заказ 8070/36 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г.ужгород, ул. Гагарина,1 1

tl 11

101