Устройство для препаративного электрофореза в полиакриламидном геле

 

Изобретение позволяет увеличить нагрузку полиакриламидного геля (ПААГ) разделяемым веществом и повысить качество разделения за счет предотвращения возникновения в ПААГ градиентов температуры, исключения возможности механического смещения ПААГ во время электрофореза и возникновения застойных зон в приемном канале камеры для сбора фракций во время их элюирования. Для этого электрофоретическая камера 1 снабжена спиралевидным внутренним теплообменником 5 и охлаждающей рубашкой 6, проходящими внутри камеры 1 трубками 7 для пропускания элюирующего растворителя, продольным приемным каналом 11 в съемной камере 4 для сбора фракций и электромагнитным смесителем, противостоящие электромагниты 9 которого укреплены на уровне канала 11, а находящийся в этом канале перемешивающий элемент 10 совершает челночные передвижения по всей длине канала 11. 1 з.п. ф-лы, 3 ил.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК, Я0 154874 (51) 5 С О1 N 27/26

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ fKHT СССР

1 (21) 43 97858/31 -25 (22) 28. 03, 88 (46) 07,03. 90. Бюл. Р 9 (71) Институт биологической физики

АН СССР (72) А. В.Ткаченко (53) 543 . 257 (088.8) 1 (56) Маурер Г. Диск для электрофореэа. — М.: Мир, 1971, с. 151-154, Duesberg P.Н. et all. Analyt, Biochem., 1965, ч. 29, р. 411.

2 (54) УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПРЕПАРАТИВНОГО

ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАИЩНОМ

ГЕЛЕ (57) Изобретение позволяет увеличить нагрузку полиак риламидного геля (IIAAI) разделяемым веществом и повысить качество разделения эа счет предотвращения возникновения в ПААГ градиентов температуры, исключения возможности механического смещения ПААГ во время электрофореза и возникновения застойных зон в приемном канале камеры для

3, сбо ра Фрак пий во в ремя их элюирования. Для этого электрофоретическая камера 1 снабжена спиралевидным Внут ренним теплообменником 5 и охлаждающей рубашкой 6, проходящими внутри камеры 1 трубками 7 для пропускания элюирующего растворителя, продольным приемным каналом 11 в съемной каме1 548740 ре 4 для сбора Фракций и электромагнитным смесителем, противостоящие электромагниты 9 которого укреплены

5 на уровне канала 11, а находящийся в этом канале перемешивающий элемент

1 О совершает челночные передвижения по всей длине канала 11. 1 з.п. Ф-лы, 3 ип, Изобретение относится к препара !ивной лабораторной технике, в част !ости к устройствам для электроФореза геле, и может быть использовано для !Роведения препаративных работ, свя !анных, например, с тонкой химической

9ли биологической технологией, с заДачами экспериментальной и клинической r ем а толо г ии для ре шеи ия п ро блем, возникающих при получении кровезаменителей, Цель изобретения — улучшение эФфективности препаративного электрофо1 еза, повышение качества разделения

И производительности фореза путем

Предотвращения возникновения в геле градиентов температуры.

На фиг.l.изображено устройство для г1репаративного электрофореза, на фиг.2 — результаты двух режимов злю сии; на фиг . 3 — ре зульта ты аналити еского электрофореза.

Предлагемое устройство представх1яет собой цилиндрическую вертикальную изготовленную из минерального . с1текла элекФрофоретическую камеру 1, цомещенную между верхней 2 и нижней

1 электродными ваннами. Камера 1 соединена со съемной камерой 4 для сбора фракций. Камера 1 снабжена витым (в виде спирали) внутренним теплообменником 5 и охлаждающей рубашкой 6, а также проходящими внутри камеры l трубками 7 для пропускания элюирующего растворителя и изогнутой трубкой 8. Камера I выполнена из двух соединяющихся друг с другом нормальным шлифом частей, причем в верхнюю (съемную) часть вмонтированью1внутренний теплообменник 5 и трубки 7, вводимые во внутреннее пространство нижней (стационарной) части, снабженной охлаждающей рубашкой 6.

Устройство снабжено электромагнитным смесителем, состоящим из двух противостоящих электромагнитов 9, установленных на уровне камеры 4, перемешиваюшего элемента. 10 в виде Ферромагнитного стержня в стеклянной оболочке, свободно расположенного в образуемом при полимеризации геля в камере l продольном узком приемном ка-: нале 11 камеры 4, и расположенных вне устройства мультивибратора и блока электропитания (не обозначены) ..

Верхняя 2 и нижняя 3 электродные ванны снабжены платиновыми электродами 12, заключенными в стеклянную оболочку с перфорациями, охлаждающими рубашками 13 и коаксиально располо— женными внутренними витыми (в виде спирали) теплообменниками 14. Камера

4 снабжена полупроницр.емой мембраной

I5. Верхняя электродная ванна снабжена сливным штуиером 16.

Предлагемое устройство работает следующим об ра зом.

Соединяют верхнюю и нижнюю части

4р камеры 1 друг с Другом Нижнее отвеpстие камеры 4 закрывают полупронипаемой мембраной 5 (например, иеллофа— ном), которая служит дном камеры 4.

На внутреннюю поверхность дна камеры

4 укладывают шаблон из органического стекла (25 3,0 2,О мм), располагая

его по диаметру закрытого мембраной нижнего отверстия камеры 4. Камеру 4 закрепляют на нижней части камеры I так, чтобы упомянутый шаблон находился в одной плоскости с обеими трубкамн 7. Одну из трубок 7 закрывают наглухо, а по другой через присоединенный к ее верхней части резиновый

55 . шланг на дно камеры 4 ввоцят 10-14 мл

Ф буферного раствора, служащего рас творителем при приготовлении смеси акриламида и N,N -метилен-бис-акриламида (смесь мономеров) . Затем через тот

5 1 5487 же шланг под слой введенного бу Ае рно-. го раствора вводят смесь мономеров, содержащую персульАат аммония, TEHED и сахарозу, Сначала вводят 1 07-ную смесь мономеров, содержащую 0,1 X сахарозы до нужного уровня в камере I ..

Затем под столб I OX-ной смеси мономеров вводят 307-ную смесь мономеров, содержащую 0,27 сахарозы, чтобы эта 10 порция (5 мл) слегка покрыла верхнюю поверхность помещенного в камеру 4 шаблона.

Заполнение камеры 4 и камеры 1 производят так, чтобы поверхность 15 раздела между вводимыми растворами сохранилась интактной вплоть до заполнения каме ры 1 до нужного уровня. !

Заполнив камеру 1, ее оставляют в вертикальном положении вплоть до завершения полимеризации геля. После полимеразации его шланг, служащий для введения смеси мономеров, отсоединяют от одной из трубок 7 и закрывают ее. Верхний слой из бунерного раство- 25 ра удаляют из камеры 1, Камеру 4 снимают, отделяют от камеры 1, прочищают ее и, сполоснув дистиллированной водой, отставляют при комнатной температуре. Трубки 7 тщательно прочи- 30 щают, восстанавливая полностью их проходимость на всей протяженности.

Из открытой лосле снятия камеры 4 поверхности нижнего конца столбца геля уд ал яют ша б ло н, !

40

По заве ршении электронно реза с истему протока хладагента через охлаждающие рубашки и внутренние теплообменники перекрывают. Составляющие эту систему шланги отсоединяют. Источники электропитания отключают. Удаляют нижнюю электродную ванну 3. Отделяют верхнюю электродную ванну 2 от электрофоретнческой камеры . Из трубок 7 и 8 извлекают полиэтиленовые нланги.

Отсоединяют камеру для сбора йракций

4 от электрофоретической камеры 1.

Освобождают камеру 4 от полупронипаеОстающуюся в геле после извлечения шаблона канавку обрабатывают скальпелем, углубляясь на 1,0-1,5 мм. В канавку вкладь.вают ферромагнитный стержень 10 в стеклянной оболочке.

Заполняют канавку элюирующим растворителем. Выходные отверстия нижней части трубок 7 должны бь1ть свободными и должны сообщать трубки 7 с полос- 45 тью канавки без каких-,либо препятствий, Камеру 4 вновь соединяют с ниж— ней частью камеры 1, При этом канавка в геле превращается в продольный узкий приемный канал 11 со свободно расположенным в нем перемешивающим элементом 10. Подключают противостоящие на уровне дна камеры 4 электромагниты 9 и проверяют подвижность перемешивающего элемента 10 в канале

11: элемент 10 должен при этом совершать челночные передвижения по всей длине канала I I .Верхнюю электродную ванну 2 соединяют с камерой 1.

Через шланг в трубке 8 в камеру 1 вводят порпию электродного буферного раствора так, чтобы этот раствор не вытекал из трубки 8, после чего на верхнюю поверхность столба геля под слой введенного буферного раствора вводят раствор подвергаемого разделению образца, содержащий сахарозу (0,17) . Трубку 8 вместе с введенным в нее полиэтиленовым шлангом закpblBают.

Электродную ванну 2, закрыв штуцер

16, осторожно заполняют электродным буфе рным ра с т во ром . Ус т ройс тво зак репляют в штативе так, что камера 4 оказыв а ется по г руже нно и в электродный буферный раствор, находящийся в нижней электродной ванне 3. В трубки 7 вводят полиэтиленовые шланги так, . чтобы введенные концы шлангов были расположены в приемном канале 11 на высоте ж 0,5-1,0 мм над дном камеры

4. Через один из этих шлангов в камеру 4 вводят электродный бу*ерный раствор, заполняя им приемный канал 11 камеры 4. Включают систему протока хладагента через охлаждающие рубанки и внутренние теплообменники, блок электропитания (не обозначен) платиновых электродов 12 и источник электропитания (не обозначен) электромагтов 9.

Контролировать ход электройоретического разделения можно путем анализ а фрак ций не п ре рыв ной ип и и ре рыв истой элюции содержимого приемного канала 11 камеры 4, направляя порции элюата на какой-либо регистрирующий прибор и/или на коллектор *ракций.

Таким же путем и в таком же режиме можно извлекать из приемного канала камеры 4 поступающие в него индивидуальные ApBKIJHH Извлекать последние можно, кроме того, снимая камеру

4 и заменяя ее аналогичной камерой. !

1548740 мой мембраны 15 и перемещающего элемента 1 О. Заполнявший камеру 1 гель разрушают и удаляют. Все детали разобранного устройства хорошо поддают5 ся очистке, мойке и сушке.

Пример, Выделение мономерного сывороточного альбумина из препаратов сывороточного альбумина человека и крупного рогатого скота. 10

Препа рат сывороточного альбумина

««еловека окрашивали известным способом пропионовьм ярко-синим RS. Навесgó (80 мг) лиофипизированного окра-! шенного белка растворили в 1 мл элек-! тродного трисглииинового буферного створа (рН 8,8), Раствор белка, соержащий добавленную сахарову (0,1Х)

IH добавленный свободный проционовый раситель (0,3 мг), ввели в электро- 20 оретическую камеру 1 (фиг.l.) диаметом 3,4 см и высотой 4,5 см, заполенную 10Х-ньм ПААГ (рН 8,3). Нагруза геля белком 9 мг/см . Электройог ез п ров одили при напряжении 500 В в ечение 18 ч (сила тока 12-18 мА) .

В ходе электрофореза происходит еткое разделение в геле фракций своодного мономерного и ассоциированно» о свободного красителя, мономерного, 30 име рно го и прочих олигоме рных форм, льбумина без каких-либо деформаций

«перечисленных фракций и без какихлибо локальных нарушений их миграции геле, которые обычно возникают ив. а неравномерности охлаждения геля и орчирования в нем градиентов темпеатур.;;. Электрофорез при использова« ии предлагаемого устройства можно

«!рерывать на 8-10 ч, отключая устрой- 40 с,тво от источника электропитания. К моменту возобновления электрофореза с ам столб геля в электрофоретической

Камере и разделенные в нем Фракции сохраняли свое положение практически 45 без изменений.

Извлечение фракций иэ камеры для сбора фракций 4 (фиг ° l ) производили в режиме непрерывной элюцни с включенной или выключенной электромагнит- 50 ной мешалкой, начиная элюпию через.

10 ч после начала фореза. Результаты, Полученные при указанных двух режимах элюции, представлены на фиг.2.

На фиг.2 видно, что элюция фракЦий из камеры для их сбора при выклн ч енной электромагнитной мешалке не

Дает четкого разделения элюируемых фракций за счет возникновения в приемном канале 11 камеры 4 (фиг. 1) застойных зон и сорбции d«pBK««HA на внутренних стенках канала. Включение электромагнитной мешалки и связанное с этим интенсивное постоянное перемещивание содержимого приемного канала 11 резко и значительно повыцает качество разделения элюируемых Аракций и несколько повьш ает их количественный выход за счет устранения застойных зон в канале и сорбции белков íà его стен к ах, Извлеченную из приемного канала 11 камеры 4 для сбора Фракций (фиг. 1) фракцию мономерного альбумина подвергалии аналитическому элек троЬо реву в ПААГ в микроэлектрофоретической камере с последующей окраской геля кумасси-синим G-250 °

Результать аналитического электрофореза представлены на Ьиг.3. Из фиг.3 видно, что с помощью предлагаемого устройства для препаративного электрофореза в ПААГ удалось получить фракцию мономерного альбумина, полностью освобожденную от димерной и прочих олигомерных форм белка (дорожKH 17-20), находящихся в исходном интактном белковом препарате (дорожки

21 -23) . Выход мономерного белка сос— тавлял 68 мг.

Аналогичные результаты получили также при использовании предлагаемого устройства для электрофореза неокрашенного сывороточного альбумина челока, окрашенного порционовым яркосиним RS сывороточного альбумина и неокрашенного сывороточного альбумина крупного рога того ско та.

Ф о р м у л а и. з î 6 «р е т е н и я

1. Устройство для препаративного электрофореза в полиакриламидном геле, содержащее помещенную между двумя электродными ваннами цилиндрическую вертикальную электрофоретическую камеру со столбом геля, внутренним теплообменником и охлаждающей рубашкой, камеру для сбора фракций и источник постоянного тока, о т л и— ч а ю щ е е с я тем, что, с целью повышения производительности работь устройства, повышения качества разделения в геле при сохранении высокого качества разделения конечных продуктов, электрофоретическая камера дополнительно снабжена трубками для

1548740. створителя, выполнены отливЂ

5 в нешний рен него и ропус к ания элюируище го ра внутренние теплообменники в виде спирали.

2. Устройство по п..l, чающееся тем,что диаметр витка спирали внут теплообменника электройоретической камеры составляет 0,71-0,73, диаметр теплообменника О, 13-0, 15 ее диаметра, а расстояние между его витками составляет 0,14-0,16 высоты находящегося в ней столба геля.

О 14 15 16 и ó8

Вреня вице(иг)

5uz.Г

17 И 1У гО z1 ZZ Z5

Составитель И.Рогаль

Редактор В.Данко Техред M.Ходанич Корректор Л.Бескид

Заказ 139 Тираж 50á Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101