Способ получения ферментов

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению биологически активных веществ непрерывным способом и может быть использовано в микробиологической и медицинской отраслях промышленности. Целью изобретения является повышение продуктивности мицелиальных микроорганизмов - продуцентов ферментов за счет одновременного выхода нескольких целевых продуктов, синтезируемых продуцентом в разных фазах роста. Получение ферментов осуществляют путем многофазового культивирования в жидких питательных средах, которое осуществляется одновременно в нескольких последовательно соединенных сосудах, работающих по принципу аппаратов полного вытеснения, в которых создают однонаправленный ламинарный поток свежей питательной среды. При этом с выхода последующих сосудов отбирают часть культуральной жидкости, обогащают ее кислородом и подают в предыдущие сосуды, а целевые продукты отбирают по стадиям их максимального образования и выделяют известными способами, причем параметры, оптимальные для биосинтеза каждого из продуктов, поддерживают в каждом из последовательно соединенных сосудов индивидуально. Предложенный способ расширяет возможности управления микробным метаболизмом и приводит к повышению выхода целевых продуктов по сравнению с известными способами получения ферментов при периодическом и двухстадийном батарейном культивировании. 1 ил.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

К(ЫРЗЯ3

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (2I) 4375762/30-13 (22) 08.02.88 (46) 07.04.90. Бюл. N 13 (71) Специальное конструкторское бюро биологического приборостроения

АН СССР, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов и Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (72) Б.Ф,Нестеров, A.Н.Шкидченко и Б.А.Величко (53) 577,15(088.8) (56) Патент США 11 4670397, кл, С 12 М 1/02, 1987.

Патент США Ф 4379846, кл, С 12 М !/02, 1983. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению биологически активных веществ непрерывным способом, и может быть использовано в микробиологической и медицинской отраслях промышленности.

Целью изобретения является повышение продуктивности мицелиальных микроорганизмов. — продуцентов ферментов за счет одновременного выхода нескольких целевых продуктов, синтезиИзобретение относится к биотехнологии, в частности к получению биологически активных веществ непрерывным способом, и может быть использовано в микробиологической и медицинской промышленности.

Целью изобретения является повышение продуктивности культур за счет

ÄSUÄÄ 1555362 А 1 (5l)5 С 12 N 9/00 С 12 M 1 02

2 руемых продуцентом в разных фазах роста. Получение ферментов осуществляют путем многофаэового культивирования в жидких питательных средах, которое осуществляется одновременно в в нескольких последовательно соеди" ненньгх сосудах, работающих по принципу аппаратов полного вытеснения, в которых создают однонаправленный ламинарный поток свежей питательной среды. При этом с выхода последующих сосудов отбирают часть культуральной жидкости, обогащают ее кислородом и подают в предыдущие сосуды, а целевые продукты отбирают по стадиям их максимального образования и выделяют известными способами, причем параметры, оптимальные для биосинтеза каждого из продуктов, под-. держивают в каждом из последовательно соединенных сосудов индивидуально. Предложенный способ расширяет возможности управления микробным метаболизмом и приводит к повышению выхода целевых продуктов по сравнению с известными способами получения ферментов при периодическом и двухстадийном батарейном культивировании. 1 ил. одновременного выхода нескольких целевых продуктов, синтезируемых продуцентов в разных фазах роста.

На чертеже показана схема, реализующая предлагаемый способ.

Культивирование продуцента ведут одновременно в нескольких последовательно соединенных сосудах, работаю1555362 щих по принципу аппарата полного вытеснения, в которых создают однонаправленный ламннарный поток (К (2300) свежей питательной среды по поверхности фиксированного слоя мицелия. При этом с выхода одного или нескольких последующих сосудов отбирают часть культуральной жидкости, обогащают ее кислородом и вводят в предыдущие сосуды.

По мере направленного перемещения культуральной жидкости относительно мицелия продуцента она обед няется питательными веществами и обо,гащается продуктами метаболизма и углекислым газом.

Тем самым в каждом последующем сосуде создаются условия, отличающиеся от предыдущего в обуславливающие оп,ределенную физиологическую активность культуры и характер синтезируемых ею биополимеров.

Таким образом, повторное заведение части культуральной жидкости из последующего сосуда в предыдущий позволяет получить в последующем сосуде увеличенную концентрацию целевого метаболита, тем самым дополнительно индуцируя его биосинтез в предыдущем сосуде, что приводит к повышению выхода целевого продукта.

Такой обратный. переток части культуральной жидкости может быть организован как между соседними (смежными) сосудами, так и через один или несколько сосудов. Этот рецикл части культуральной жидкости делает весь процесс культивирования ступенчатоуправляемым, а поддержание скорости каждого из таких рециклов (в каждой паре сосудов) на определенном уровие в сумме с постоянным основным протоком культуральной жидкости через все сосуды обеспечивает стабильность каждого из состояний мицелия продуцента.

Способ осуществляют следующим образом, Последовательно соединенные сосуды 1-5 с развитой внутренней поверхностью заполняют стерильной питательной средой до полного заполнения их геометрического объема, термостатируют, вносят инокулюм и обеспечивают рециркуляцию жидкой фазы по направлению от 1 к 5.в течение 30-40 мин для гомогенного рас пределения инокулюма, Затем рецир55

Сосуды заполняют питательной средой указанного состава, термостати" руют при 30 С; вносят инокулюм и о включают рецнрк уляцию культуральной

I среды на 30 мин в направлении от 1 к 4 сосуду, затем ведут процесс пекуляцию отключают, включают аэрацию воздухом, обогащенным кислородом до

30-40Х от объема, со скоростью

0,4-0,6 л воздуха/л среды/мин и ведут культивирование периодическим . способом в течение 16-72 ч в зависимости от используемого штамма-продуцента.

После перехода культуры в фазу замедления роста на вход первого культивиционного сосуда подают свежую питательную среду со скоростью разбавления D в диапазоне 0,01-0,2 ч- и,. последовательно вытесняют ее и предшествовавшую ей культуральную жидкость иэ сосуда в сосуд в направлении от 1 к 5, В случае необходимости последовательно соединенные сосуды термостатируют при разных температурах и дополнительно обогащают импульсным введением кислорода в жид-.: кую фазу на уровне от 2 до 5 сосудов, Кроме того, часть культуральной жидкости иэ сосуда 3 (или 4 нли 5) после обогащения кислородом возвращают, например, в сосуд 2 (или 3, или 4), осуществляя частичную рециркуляцию культуральной жидкости по замкнутому контуру, Съем целевого продукта осуществляют, например, иэ одного из этих сосудов в фазах его максимального выхода.

Пример 1. Культуру дрожжей

35 Endomycopsis fibuliger 5513 в качестве продуцента амилолитических ферментов выращивали в жидкой питательной среде. следующего состава, 7: крах40 мал, кукурузный 1, 0; КН2РО 4 О, 5; кукурузный экстракт 1,0.

Культивирование продуцента ведут в установке, состоящей из сосудов

1-4, последовательно соединенных по принципу аппарата полного вытеснения, Аэрацию осуществляют продувкой воз- духа, обогащенного кислородом, из расчета 0 5 л/л/мин. Поддержание рН обеспечивают автоматической подтит50 ровкой 0,5 NaOH и стабилизируют в сосудах 1 и 2 на уровне 5,5-5,6,.а в сосудах 3 и 4 на уровне 4,5-S 0, I

15

25

35

45

55

5 155536 риодического культивирования в тече-ние 72 ч.

После этого на вход сосуда 1 подавали свежую питательную среду с

0 = 0,1 ч и постепенно вытесняют .1 ее в последующие сосуды, Из сосуда 4 отработанную культуральную жидкость, обогащенную чистым кислородом, подают в сосуд 3 с D=0,02 ч-, В культуральной жидкости, отбиравшейся иэ всех четырех фаз культивирования, определяют активность глюкоамилазы и

d-амилазы, Глюкоамилазная активность достигает максимума в сосуде 2 установки и составляет 46 мкмоль/мл, что в 4 раза выше, чем при периодическом культивировании, и в 3,8 раза выше, чем при двухстадийном культивировании в ферментерах идеального смешения, Активность d-амилазы достигает максимума в сосуде 4 установки и составляет 3,4 ед/мл, что в 7 раз выше, чем при периодическом культивировании в 12 раз выше, чем при двухстадийном культивировании в ферментерах идеального смешения.

Пример 2. Все операции как в примере 1, но отбор культуральной жидкости из сосуда 4 и подача ее в сосуд 3 отсутствуют,. Аналогично примеру 1 определяют активность глюкоамилазы и Ы-амилазы. Максимум глюкоамилазной активности наблюдается в сосуде 2, а максимум активности

Ы-амилазы в - сосуде 4. Однако числовые величины этих активностей снижаются по сравнению с примером 1: глюкоамилазы — в 2,2 раза (20,9 мкмоль/мл), о -амилазы — в 1,8 раза (1,88 ед/мл).

Пример 3. Все операции как в примере 1 с тем отличием, что отбор культуральной жидкости из сосуда 4 и подачу ее в сосуд 3 осуществляют с D=0,08 ч- . Максимум глюко- амилазной активности наблюдается в сосуде 2, а максимум активности (-амилазы в сосуде 4. Однако числовые величины этих активностей снижаются по сравнению с примером 1: глюкоамилазы — в 2,4 раза (19,16мкмоль/мл) е1-амилазы — в 3,1 раза (1,09 ед/мл).

Пример 4. Культуру актиномицетов Actinomyces jantinus 118 в качестве продуцента ингибитора трипсина выращивают на жидкой питательной среде следующего состава ° мас,7.: пелтон 5,0; перевар Хоттингера 30мл, 2 6 глюкоза 10,0; NaC1 5,0. Стабилизируют рН среды подтитровкой 0,5 н.

Na0H в зоне 6,8-7,0, культивирование осуществляют в установке, представляющей три последовательно соединенных сосуда полнбго вытеснения с развитой внутренней поверхностью.

Установку заполняют питательной средой укаэанного состава, термостатируют при 28 С, вносят инокулюм и включают рециркуляцию питательной среды на 30 мин по замкнутому контуру. Периодическое культивирование, осуществляют в течение 40 ч, а за тем в сосуд 1 подают свежую питательную среду с D=O 12 ч и вытесняют жидкую фазу потоком в последующие сосуды, При этом сосуды 1 и 2 термос статируют при 28 С, а сосуд 3 - при

34 С.

Культуральную жидкость из сосуда

3 насыщают кислородом и с 0=0,03 ч дополнительно вводят в сосуд 2 установки.

В культуральной жидкости, отбиравшейся из каждого сосуда, определяют антитрипсиновую активность по изменению эстеразной активности трипсина, используя в качестве субстрата тозил-Z-аргининметиловый спирт, В сосуде 1 активность ингибито ра составляет 3 ед, в сосуде 2 8 ед. н в сосуде 3 18 ед, что в 4 рава выше, чем максимальная активность, достигаемая при периодическом культивировании.

Пример 5. Методики и режимьг те же, что и в примере 4 с тем лишь отличием, что отбор культуральной жидкости из сосуда 3 и подачу ее в сосуд 2 осуществляют с D=0,02 ч

В результате активность ингибитора составляет в сосуде 1 3 ед, в сосуде 2 5 ед, в сосуде 3 14 ед, Пример 6. Повторяют все методики и режимы примера 4 с.тем .. лишь отличием, что отбор культуральной жидкости из сосуда 3 и подачу ее в сосуд 2 осуществляют с Р0,05 ч .

В результате активность ингибитора составляет в сосуде 1 3 ед в сосуде 2 6 ед, в сосуде 3 1.2 ед, Пример 7, Повторяют все мвтодики и режимы примера 4 с тем . лишь отличием, что сосуд 3 термостатируют при 28 С, 1555362

В результате активность ингибитора составляет в сосуде 1 3 ед, в сосуде 2 8 ед, в сосуде 3 10 ед, Пример 8. Культуру актиномицета Actinomyces Kurssanovii 75 в качестве продуцента хитинолитических ферментов выращивают на жидкой питательной среде следующего состава, г/л: :

Культивирование продуцента ведут в установке, состоящей из 4-после, довательно соединенных сосудов полного вытеснения с развитой внутренней поверхностью.

Сосуды заполняют питательной средой указанного состава, термостатируют при 30 С, вносят инокулюм и на ,30 мин выключают рециркуляцию среды по замкнутому контуру. Затем в течение 16 ч осуществляют периодическое культивирование гриба с азрацией от

1-го к 4-му сосуду. Затем в сосуд 25

1 подают. свежую питательную среду с

0 0,15 ч и постепенно вытесняют ее в направлении сосуда 4. Часть культуральной жидкости с выхода сосуда 4 обогащают кислородом и с D=0 05 ч 30 подают в сосуд 2„ а термостатирование сосуда 3 осуществляют при 34 С и в него дополнительно подают воздух, обогащенный кислородом до 40 со скоростью 0,1 л/л/мин, В культуральной жидкости, отбиравшейся из каждого сосуда, определяют активность хитиназы (СН,-фермент) и активность СН „-фермента, расщепляющего коллоидный хитин, а также 40 активность фермента, расщепляющего

N-N-диацетилхитобиозу и другие короткие олигосахариды хитинового ряда, Активность хитиназы (СН„-фермент) 45 достигает максимума в сосуде 2 и составляет 22 ед или 2,2 раза выше, чем при периодическом культивировании, а затем снижается.

МаксимУм активности СН„-фермента достигается в сосуде 3 и составляет

32 ед или в 4 раза вышее, чем при периодическом культивировании, а максимальная активность фермента, расщепляющего короткие олигосахариды

1 хитинового ряда, повышается в сосуде 4 и в 2,8 раза превосходит обнаруженную при периодическом культивировании.

П р и и е р 9. Повторяют все методики и режимы примера 8 с тем лишь отличием, что отбираемую из сосуда

4 и подаваемую в сосуд 2 культуральную жидкость не обогащают кислородом, В результате максимум активности хитиназы (СН „-Фермент) наблюдается в сосуде 2 и составляет 12 ед, что в

1,8 раза ниже, чем в примере 8, максимум активности СН „-фермента наблюдается в сосуде 3 и составляет 15ед, что в 2,1 раза ниже, чем в примере

8, максимум активности фермента, расщепляющего короткие олигосахариды хитинового ряда, вновь наблюдается в сосуде 4, однако он в 1,5 раза ниже, чем в примере 8.

Пример 10. Повторяют все методики и режимы примера 8 с тем лишь отличием, что термостатирование сосуда 3 осуществляют при 38 С.

В результате все виды проверяемых активностей в сосудах, за исключением первого, снизилась ориентировочно в 4-5 раз по сравнению с примером 8, Предлагаемый способ позволяет управлять биосинтезом ферментов на каждой фазе роста продуцента, разделить выход целевых продуктов по отдельным стадиям и повысить их выход в несколько раз по сравнению с известными способами при периодическом и двухстадийном батарейном культивировании мицелиальных форм микроорганизмов, Формула из обре тения

Способ получения ферментов, предусматривающий многофазовое культивирование мицелиальных форм микроорганизмов на жидких питательных средах путем фиксации продуцентов на внутренних поверхностях ферментера и перемещения относительно них жидкой и газообразной фаз питательной среды с последующей стабилизацией культур в заданном физиологическом состоянии и оптимизацией параметров условий биосинтеза ферментов до максимального накопления их активности, отличающийся тем, что, с целью повышения продуктивности культур за счет одновременного выхода нескольких целевых продуктов, синтезируемых продуцентами в разных фазах роста, культивирование ведут!

55536

Составитель В.Соина .Редактор Н.Рогулич Техред А.Кравчук Корректор М.Шароши !

Заказ 538 Тираж 487 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

133035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/5,Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,103 одновременно в нескольких последовательно соединенных сосудах, работаю- . щих пб принципу аппаратов полного вытеснения в условиях однонаправ5 ленного ламинарного потока свежей питательной среды, при этом на выходе каждого иэ сосудов отбирают часть культуральной жидкости, равной по

2 о объему подаваемой свежей .питатеЛьнойсреды, аэрируют ее и вновь подают всосуд с последующим отбором и выделе; нием целевых продуктов в стадии их максимального образования, прйчем в каждом иэ сосудов поддерживают параметры, оптимальные для биосинтеэа соответствующих ферментов,