Штамм бактерий bacillus тнuringiеnsis - продуцент рестриктазы изошизомера
Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и представляет собой штамм BACILLUS THURINGIENSIS ВКПМ В-4287, продуцирующий рестриктазу, названную BTU-1 и узнающую последовательность нуклеотидов 5 @ - ATCGAT-3 @ . Штамм выделен из природного материала в результате поиска штаммов-продуцентов рестриктазы путем оценки эффективности посева различных бактериофагов. Штамм хорошо растет на простой по составу питательной среде и выделяет только одну рестриктазу, что значительно упрощает ее выделение. Выход фермента составляет 5000 ед/г сырой биомассы. 1 табл.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН
SEE:Иаыг впитав, „„--,д@
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
H А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (2 1) 4420991/30-13 (22) 04.05.88 (46) 23.02.90. Бюл. N 7 (71) Всесоюзный научно-иссЛедовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) P.P.Àsèçáåêÿí, Б.А.Ребентиш и Е.М.Нетыкса (53) 577 ° 15(088 ° 8) (56) Штамм Caryophanon latum. Nucl.
Acids Res 1981, 9, 4833. (54) lllTAMN БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS — ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ ИЗОШИЗОМЕРА (57) Изобретение относится к биотехИзобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии и представляет собой штамм В. thuring1ensis, продуцирующий эндонуклеазу (рестриктазу), названную Btu-I и узнающую последовательность нуклеотидов
5 -ATCGAT-3
Рестриктаза Btu может быть использована при исследовании первичной структуры ДНК и в генной инженерии при конструировании рекомбииантных
ДНК.
Целью изобретения является создание высокопродуктивного штамма Bacillus thuringiensis ВКПМ В-4287 продуцента рестриктаэы Btu-I изошизомера Cla I, продуцирующего только одну рестриктаэу.
Штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) позволяет получить рестриктаэу Btu I нзошизомер Cla I
„„Я0„„1544802 А1 (5)) 5 С 12 N 9/223 9/14
2 нологии и генной инженерии и представляет собой штамм Bacillus thuringiensis ВКПМ В-4287, продуцирующий рестриктазу, названную Btu-I и узнающую последовательность нуклеотидов 5—
ATCGAT-3 . Штамм выделен иэ природного материала в результате поиска штаммов-продуцентов рестриктазы путем оценки эффективности посева,различных бактериофагов. Штамм хорошо растет на простой по составу питательной среде и выделяет только одну рестриктазу, что значительно упрощает ее выделение. Выход фермента составляет 5000 ед./r сырой биомассы. 1 табл. в количестве до 5000 ед./г сырой биомассы. Предлагаемый штамм хорошо растет на питательной среде простого состава и продуцирует одну рестрик,тазу, что значительно упрощает ее выделение ° ©ч
Предлагаемьй штамм В. thuringiensis ф
BKIIM В-4287 (ВНИИ генетики 16-И-48) - ф выделен из природного материала в результате поиска штаммов — продуцентов рестриктаэы путем оценки эффективности посева различных бактериофагов.
Исследуемый штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) обладает следующими морфологическими, Ь культуральными и физиологическими признаками. Морфоло гические признаки: граммположительные палочки, перетрихи раз- мером (1,5-1,9) х(3-6) мкм, образует
1544802
25 споры и вытянутые мелкие ромбовидные кристаллы.
Культуральные признаки . на агаризованной среде Хоттингера через
24 ч роста при 30 С штамм В, thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) образует шероховатые колонии с серым отливом, края ровные, центр более плотный, возвышается н виде "пугов- 10 ки", вокруг которой четко виден валик, d 3-10 мм.
На среде KIA через 24 ч при 30 С образует колонии с ровными краями, поверхность шероховатая, в центре едва заметное возвышение, по краю валик, d 3-8 мм.
На дроюке-полисахаридной среде
100 r сорбита, 60 мл дрожжевого автолизата, 1 г (NH4) thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48), образует колонии плоские, с несколь-ко различными краями, центр более плотный, блестящий, d 3-8 мм. Физиолого-биохимические признаки. Отношение к источникам углерода. Штамм В. thuringiensis сбраживает глюкозу, сахарозу. Не использует маннозу, салицин, эскулин . Образует ТЫЕ (Т11-эстеразу), не образует лецитин, Отношение к источникам азота. Усваивает аминный азот белков. Отношение к .температуре: растет ат 28-37"С, оптимум 30 С. Отношение к рН среды. растет при рН от 5,8-7,2, оптимум рН 7.,0. Отношение к кислороду: аэроб„ Штамм не патогенен. Культура хранится на агаризованной среде Хоттингера под вазелиноным маслом. Штамм В, thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) продуцирует рестриктазу со специфичностью 5 АТССАТ,. ня- 45 званную Вгп-I, согласно общепризнан— ной номенклатуре. Рестриктаза Btu-I чувствительна к метилиронанию внутреннего аденинового основания в сайте узнавания, 50 .Оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5-8,0, оптимальНая температура действия рестриктазы о 37-40 С, для активности фермента требуются ионы Mg (5-10 MM). Фермент 2+ активизируется небольшими концентрациями ИаС1 (25-50 мМ). За единицу ак.;ивности принимается количестно фермента, вызывающее полное расщепление 1 мкг ДНК cbara лямбда за I ч инкуба= ции при 37 С. Состав буфера: 10 мМ трис-HC1, 50 MM NaC1, 10 мМ MgC1<, 10 мМ 2-МЭ, рН 7 5. Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемых рестриктазой Btu I проводили гидролиз ею ДНК различного происхождения, для которой известна нуклеотидная последовательность: бактериофага лямбда (9 ), ф Х174 РФ, М13, вируса SV 40, плазмиды РВР322,. Расщепление ДНК пронодят в реакционной среде следующего состава: 10 мМ трисHCl (pH 7,5) 6 мМ 2-мерпатоэтанола, 6 мМ МяС1 и 50 мМ NaC1 при 37 С. Количество фрагментов, полученных при расщеплении различных ДНК рестриктаэой Btu-I позволяет однозначно установить сайт узнавания — 5 ATCGAT (Gene, 10, 357, 1980). Количество сайтов расщепления для рестриктазы Btu-I u Cla I на ДНК различного происхождения приведено в таблице. ДНК Рестриктаза изошиэомера— рВР322 йО ) 2174 М12 0 2 0 2 В u-I Cla I Таким образом, рестриктаза Btu является изошизомером ранее описанной и широко используемой в генной инженерии, молекулярной биологии и биотехнологии рестриктазы Сlа I. Рестриктаза Btu-I no характеру своего действия аналогично рестриктаэе Cla I чувствительна к dam-метилированию, Пример. Штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) поддерживают в пробирках на .агаризованной среде Хоттингера под вазелиновым маслом, Для оживления штамм пересевают на агар Хоттингера и инкубируют при 37 C 19 ч. Затем пересевают в проо бирки с 5 мп бульона Хоттингера и инкубируют при 37 С 4 ч на качалке. о Такую культуральную жидкость вносят в соотношении 1:50 в 250 мл бульона Хоттингера в колбы объемом 650 мл и выращивают на круговой качалке при 250 об/мин при 37 С до поздней логарифмической фазы (19 ч). Культуральную жидкость охлаждают до 4 С и центрифугируют на центрифуге "Scrval -Çñ" при 6000 об/мин 30 мин. Выход сырой Фо р мул а из о б р е те ния Составитель И.Привалова Техред g,Дидык Редактор В.Данко Корректор Н. Король Заказ 471 Тираж 482 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород., ул. Гагарина,101 5 15448 биомассы 5 r c l л культуральной жидкости. Биомассу хранят при -20 C. Для выделения фермента 1 r биомассы суспендируют в 6 мл буфера А (20 MN трис-НС1; рН 7,5; !О мМ 2-мер5 каптоэтанола, О, I мМ ЭДТА, 57. гли- церина), обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе при 50 !! в течение 8 мин и центрифугируют при 18000 об/мин. 10 60 мин, Полученный бесклеточный экстракт со скоростью 1 мп/мин наносят на колонку размером 1,5х1,9 см с ДЗАЭ-трисакрилом (ДЕАЕ-Trisaciylm "LKB", уравновешенную буфером А и подсоединенную к системе FPLC фирмы РЬаппас а (Швеция). Колонку промывают тем же буфером и элюируют градиентом NaC1 0-0,5 М в. буфере А. Общий объем градиента 20 35 мл. Наиболее активные фракции, элюируемые при 0,06-0,09 М NaC1, объединяют, диализуют против буфера А и, наносят на колонку Моно Q.HR 5/5 ("Pharmacia"), уравновешенную буфе- 25 ром А. Элюируют градиентом NaC1 (О0,5 М) в буфере А. Общий объем градиента 20 мп. Наиболее активные фракции, элюируемые при 0,2-0,25 М NaCl, объединяют, диализуют против 30 буфера В (60 мМ КРО ; рН 7,4; 10 мМ 2-мерпатоэтанола; 0,1 мМ ЗДТА; 5Х глицерина) и наносят на колонку Моно S НК ф/5 ("Pharmacia"), уравновешенI 02 6 ную буфером В. Элюируют градиентом NaC1 (0-0,5 М) в буфере В. Общий объем градиента 20 мл. Наиболее активные фракции,.элюируемые при 0,320,38 М NaC1, концентрируют диализом против буфера В с 50Х глицерина и 50 MY NaC1. Получают 1,25 мп препарата рестриктаэы Btu-I с активностью 4000 ед./мл ° Препарат фермента хранят при -20 С. Выход фермента составляет 5000 ед.jr сырой биомассы. Таким образом, предлагаемый штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) обладает следующими преимуществами по сравнению с известным штаммом: не требует для культивирования сложной питательной среды и превосходит его по продуктивности в 10 раз (5000 ед./r сырой биомассы против 450 ед./г сырой биомассы). Кроме того, предлагаемый штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) хорошо растет на простой питательной среде и обладает коротким временем культивирования: за 19 ч накапливает 5 г сырой биомассы/л культуральной жидкости. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis ВКПМ В-4287 — продуцент рестриктазы Btu-Е изошизомера Cla I.
