Способ определения чувствительности мембран эритроцитов к свободнорадикальному окислению липидов

 

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в эксперименте и клинике для определения чувствительности эритроцитов к перекисному окислению липидов. Цель - повышение специфичности и физиологичности способа при одновременном его ускорении. Центрифугируют 2 мл венозной крови, 0,25 мл осадка эритроцитов смешивают с 2,4 мл физиологического раствора, добавляют спиртовой раствор витамина Д<SB POS="POST">2</SB>, инкубируют 30 мин, затем добавляет 1,0 мл 50%-ной трихлоруксусной кислоты, центрифугируют. К надосадочной жидкости добавляют раствор соляной кислоты и тиобарбитуровой кислоты, кипятят и спектрофотометрируют. Способ позволяет определять наличие малонового диальдегида.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

РЕСПУБЛИК руд G 01 Б 33/48, 33/52

ОЛИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

E;), ГОСУДАРСТВЕННЫЙ KOMHTEY

ll0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

Н llSTOPCHOMV СВИДИВЪСТВУ! (21) 4254290/28-14 (22) 01.06,87 (46) 30.04.90. Бюл. Я 16 (71) Гродненский государственный медицинский институт (72) В.С. Васильев, Г.К. Новицкий, В.М. Цыркунов и Ф.С. Ларин (53) 612. 015 (088.8) (56) British I. Hsemotol 1971, v. 20,,Ф 1, р. 95-107. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ NENBPAH ЭРИТРОЦИТОВ К СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОМУ ОКИСЛЕНИЮ ЛИПИДОВ (57) Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в эксперименте и клинике для

Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно к методам лабораторной диагностики, и может быть использовано в эксперименте и клинике для определения чувствитель-. ности эритроцитов к перекисному окис лению липидов.

Цель изобретения — повышение специфичности и физиологичности способа при одновременном его ускорении. .Способ. осуществляют следующим образом.

Из: 2 мп венозной крови выделяют. эритроциты центрифугированием при

300 g в течение 1 0 мин,в качестве антикоагулянта используют гепарин—

200 ЕД/мл крови. Плазму и верхний слой эритроцитов, содержащий:лейкоциты, удаляют отсасыванием. Полученный осадок эритропитоя пважды отмыва

„.SU„„3561034 А 1

2 определения чувствительности эритроцитов к перекисному окислению липидов. Цель — повышение специфичности и физиологичности способа при одновременном его ускорении. Центрифугируют 2 мп венозной крови, 0,25 ма осадка эритроцитов смешивают с 2,4 мл физиологического раствора, добавляют спиртовой раствор витамина D<, инкубируют 30 мин, затем добавляют 1,0 мл

50Х-ной трихлоруксусной кислоты, центрифугируют. К надосадочной жидкости добавляют раствор соляной кислоты и тиобарбитуровой кислоты, кипятят и спектрофотометрируют. Способ позволяет чаще определять наличие малоно- д вого диальдегида. 9 ют, добавляя четырехкратный объем охлажденного физиологического раствора хлорида натрия и осаждая клетки центрифугированием при 300 g в течение 15 мин. Надосадочную жидкость вместе с верхним слоем эритроцитов удаляют отсасыванием.

0,25мл осадка эритроцитов смешивают с 2,4 мп забуференного физиологического раствора HaCl (50 мл 0,15 М фосфатного буфера рН 7,4 смешивают с .45Î мл 0,97. раствора ИаС1) и 0,35 мл

0,5Х спиртового раствора эргокальциферола (витамина 0 ). В контрольные пробирки вместо спиртового раствора витамина D . добавляют равное количество эталона. Инкубацию проводят в течение 30 мин при 37 С в водной бане. После инкубации в пробы медленно добавляют, тщательно перемешивая, 1561034

ДЕ 2 K .K,V, V2

С = - — — "1 — - — — dE 307 69 ач

3 продукция МДА в 1 мл осадка эритроцитов за 1 ч 25 инкубации, разность экстинкций опытной и контрольной проб на 532 нм; объем пробы для спектрофотометрирования; объем пробы после остановки инкубации; объем пробы, отобранный для постановки цветной ре-, 5 акции; коэффициент пересчета времени инкубации; коэффициент пересчета на ! мл осадка эритроцитон, 40 коэффициент молярной экстинкции, выраженный в нм/мл (0,156). где С

Л Е 2

К, К

К 28-33 мин продукция МДА почти достигает максимума и мало изменяется при удлинении инкубации до 1 ч, В пределах интервала времени 28-33 мин прирост продукции МДА является незначительным поэтому о11тимальным вре менем инкубации следует считать 2833 мин, Пример 1, Из 2 мл венозной крови центрифугиронанием выделяют эритроциты, в качестне антикоагулянта ° 55 используют гепарин — 200 ЕД/мл крови.

Плазму и верхний слой эритроцитов удаляют. Осадок эритроцитон дважды отме вают четырехкратным объемом охлажден1,0 мп 50% трихлоруксусной кислоты.

Пробирки центрифугируют 15 мии при

300 g. В чистые пробирки отбирают

2,0 мл надосадочной жидкости, к которой добавляют 0,2 мл н.раствора соляной кислоты и 0,8 мл 0,12 М раствора тиобарбитуроной кислоты. После кипячения.в течение 10 мин жидкость приобретает розовую окраску, по интенсивности которой и судят о количестве образовавшегося малонового диальдегнда (МДА) — в кювете 1 см определяют оптическую плотность раст-. вора при 532 нм против контроля на ре-!> активы»

Расчет продукции МДА в эритроцитах осуществляют с использованием закона Бугера-Ламберта-Бера по формуле: ного физиологического раствора хлорида натрия, осаждая клетки центрифугиронанием при 300 g в течение 15 мин.

Надосадочную жидкость вместе с верхним слоем эритроцитов удаляют.

0;25 мл осадка эритроцитон смешивают с 2,4 мп забуференного 0,9% раствора ИаС1 и 0,35 мл 0,5% спиртового раствора витамина D . Конечная кон2 центрация 0,06%. В контрольные пробирки вместо спиртового раствора эргокальциферола добавляют равное количество этанола. Инкубацию проводят в течение 30 мин при 37 С в водяной бане. После инкубации но все пробирки медленно добавляют, тщательно перемешивая, 1, 0 мл 50% раствора трихлоруксусной кислоты. Пробирки центрифугируют 15 мин при 300 g. В чистые пробирки отбирают 2,0 мп надосадочной жидкости, к которой добанляют

0,2 мл 1 н.раствора соляной кислоты и 0,8 мл 0,12 М раствора тиобарбитуроной кислоты. После кипячения н течение 1 О мин наблюдают появление розовой окраски раствора, интенсивность которой измеряют спектрофотометрически при 532 нм против контроля на реактивы. По формуле рассчитывают содержание МДА, которое в данном случае равно 34,07 нМ/ил ° ч. Содержание МДА в эритроцитах этой же пробы крови, определенное по прототипу, составило

37,84 нМ/мл ч.

Процесс инкубации эритроцитов coc-.àâèë 30 мин против 1 ч (прототип) а вместо высокотоксичного и взрывоопасного азида натрия использован нетоксичный и невзрывоопасный эргокальциферол, что обеспечивает сокращение времени и упрощение выполнения предлагаемого способа.

Пример 2. Получают осадок эритроцитов, как указано н примере

). 0,25 мл осадка эритроцитов смешивают с 2,4 мп забуференного раствора

NaC1 и 0,35 мл 0,5% спиртового раствора эргокальциферола.. В контрольные пробирк1; вместо спиртового раствора витамина D добавляют равное количество этанола. Инкубацию проводят н тео чечие 28 мин при 37 С н водяной бане.

Дальнейшая последовательность операций аналогична примеру 1, Спектрофотометрическая регистрация интенсивности розовой окраски раствора при длительности инкубации 28 мин и последующий пересчет показывают, что

1 034

Формула и з обретения

Продукция

ИДА (прототип) Светосумма быстрой вспышки хеПродукция (предлагае-. мый способ) Об следуемые группы мнлюмннесценции мембран эритроцитов нмпlмин

Контроль (n = 12)

Больные беэ холестаэа (и Il)

Больные с хопестаэом (п = 16) 43,26 2,72 36,9241,74 68751.275,4

83, 69 3,82

79,15ф2,52 15217,4g650,2

118,81+4, 70" 20140g678, 1"

86,05>3,75 — достоверные раэличия по отношению к контролю (P (0,05); — достоверные раэличия между группами боли (P 0,05).

Составитель Н. Гуляева

Редактор О. Спесивых Техред Л.Олийнык Корректор М. Кучерявая

Тираж 525

Подписное

Заказ 975

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, .осква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

5 156 количество МДА в данном случае равно 33,89 нМ/мл ч. Содержание МДА в эритроцитах этой же пробы крови, определенное по прототипу Составиt

I ло 3 7, 5 9 нМ/мл ч .

Пример 3. Осадок эритроцитов получают аналогично примеру 1.

0,25 мл осадка эритроцитов смешивают с 2,4 мл забуференного физиологического раствора NaC1 и 0,35 мл 0,5Х спиртового раствора эргокальциферола. В контрольные пробирки вместо эргокальциферола добавляют равное количество этанола. Инкубацию проводят о в течение 33 мин при 37 С в водяной бане. Последующее выявление образовавшегося МДА проводят аналогично примеру 1 В данном случае при длительности инкубации 33 мин количество МДА равно 34,22 нМ/мп.ч. Содержание МДА в эритроцитах этой же пробы крови, определенное по прототипу, составило 37,84 нМ/мл ч.

Анализ, полученных данных свидетельствует, что при использовании предлагаемого способа у больных с холестазом определяется повьш!енная продукция МДА, что подтверждается повышенным накоплением гидроперекисей), а при использовании прототипа подоб-, ные изменения не были выявлены. Указанное подтверждает большую специ-5 фичность и физиологичность предлагаемого способа по отношению к известному техническому решению.

В таблице приведены данные о продукции эритроцитарного МДА и содержании гидроперекисей (определяют хемилюминесцентным методом) в мембранах эритроцитов больных вирусным гепатитом В средней степени тяжести (с более тяжелым холестатическим вариантом заболевания и беэ него).

Способ определения чувствитель20 ности мембран эритроцитов к свободнорадикальному окислению липидов путем их инкубации с прооксидантом, добавле" ния тиобарбитуровой кислоты и спектрофотометрирования, о т л и ч а ю щ и й25 с я тем, что, с целью повышения специфичности и физиологичности способа при одновременном его ускорении инкубацию проводят с раствором эргокальциферола в конечной концентрации

30 0,06Х в течение 28-33 мин.