Способ моделирования оценки типа комбинированного токсического действия малорастворимых пылей

 

Изобретение относится к медицине, а именно к гигиене и токсикологии, и может быть использовано при оценке типа комбинированного действия малорастворимых токсических пылей на организм. Цель - повышение воспроизводимости. Белым крысам интратрахеально вводят по 1 мл суспензии исследуемых веществ, через 24 ч под гексеналовым наркозом проводят рассечение трахеи, бронхоальвеолярный лаваж и подсчет альвеолярных макрофагов, нейтрофилов. Затем строят уравнение регрессии по дозам входящих в комбинацию веществ с учетом их взаимовлияния, причем в качестве основного выбирается тот тип комбинированного действия, на который указывают не менее 75% исследуемых показателей.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (Я)5 G 01 Н 33/53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4304296 /28-14 (22) 07,09,87 (46) 07,06.90. Бюл. Р 21, (71) Свердловский научно-исследователь- ский институт гигиены труда и профзаболеваний (72) Л.И,Привалова, С.Л,Балезин и Б.А,Кацнельсон (53) 612.475(088,8) (56),Постановка экспериментальных исследований по изучению характера комбинированного действия химических веществ с целью разработки профилактических мероприятий, Методические реко-, мендации. Утв. эам,главного госуд. санит. врача СССР А.И.Заичнеко, М 4050-85, 06.12,85. — М,, 1987) с. 1-47.

Изобретение относится к медицине, а именно к гигиене и токсикологии и касается экспериментальной оценке типа комбинированного действия (аддитивного потенцирования или антагонизма) малорастворимых токсических пылей на организм, осуществляемой в целях обоснования их гигиенической регламентации при совместном присутствии в воздухе рабочих помещений, Целью изобретения является повышение воспроизводимости.

Способ осуществляют следующим образом, „„SU„„1569709 А I

2 (54) СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ОЦЕНКИ ТИПА

КОМБИНИРОВАННОГО ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ МАЛОРАСТВОР1ИЫХ ПЫЛЕЙ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к гигиене и токсикологии, и может быть использовано при оценке типа комбинированного действия малорастворимых токсических пылей на организм,. Цель — повыщение воспроизводимости. Белым крысам интратрахеально вводят по 1 мл суспензии исследуемых веществ, через 24 ч под гексеналовым наркозом проводят рассечение трахеи, бронхоальвеолярный лаваж и подсчет альвеолярных макрофагов, нейтрофилов.

Затем строят уравнение регрессии по дозам входящих в комбинацию веществ с учетом их взаимовлияния, причем в качестве основного выбирается тот тип комбинированного действия, на который указывают не менее 753 исследуемых показателей. 1 табл.

Белым крысам одного пола, возрасTB и близкой массы тела интратрахеально вводят по 1 мл стерильного физиологического раствора или по 1 мл суспенэии исследуемых веществ (изолированно либо в комбинации), Комбинации доэ подбираются в соответствии с изЭ вестными принципами планирования двухфакторных экспериментов, й.

Учитывая, что многие показатели реакций альвеолярного фагоцитоэа (РАФ) отражают,не только прямое повреждающее или стимулирующее действие отложившихся в альвеолярной об1569709 ласти частиц, но и более или менее сложно опосредованные компенсаторные сдвиги, и что зависимость последних от степени токсичности частиц и их дозы носит заведомо нелинейных харак5 тер, за основу планирования эксперимента принимают двухфакторный эксперимент с тремя уровнями для каждого фактора (матрица плана 3 ), дающий возможность построить уравнение per( рессии

Y=bo+b

Х и Х вЂ” дозы факторов (пы1 лей) .

Наряду с этим, дополнительная информация может быть получена на том же экспериментальном материале при вычленении из него данных соот1 ветствующих матрице плана 2, с по-, строением для каждого сочетания уровней факторов уравнений регрессии

Y=bъ+Ь <Х +Ь1Х1+Ь, Х,Х ., (2)

При этом.в качестве минимального уровня действия каждого фактора прини,мают отсутствие данной пыли в комби- 30 нации, два других уровня подбирают в предварительных экспериментах таким образом, чтобы по изучаемым показателям имелось четкое усиление эффекта с увеличением дозы вводимой пыли. 35

Однако нежелательно, чтобы суммарная доза пылей, вводимая при комбинировании максимальных доз каждой, пре.вышала 10 мг, так как более высокие пылевые нагрузки искажают картину

РАФ и ее зависимость от дозы.

Через 24 ч после интратрахеального введения у крыс под гексеналбвым внутрибрюшинным наркозом через надрез в трахее и введенную в него ка- 45 июлю промывают легкие in situ однократно 10 мл стерильного физиологического раствора (бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), Весь объем извлеченной из легких жидкости за исключением 50 .небольшой порции, необходимой для подсчета общего числа клеток в ней обычным меланжерным способом, подвергается центрифугированию при 200 g в течение 4 мин, Иэ осадка готовят ма- у зок, который просушивают на воздухе, фиксируют метанолом и окрашивают по

Романовскому, При микроскопировании 100-200 клеток с иммерсионным объективом подсчитывают процент альвеолярных макрофагов (AM), нейтрофильных лейкоцитов (НЛ) и прочих клеток, определяют процент явно дегенерированных АМ, измеряют средний диаметр AM подсчитывают среднее число фагоцитированных частиц в одном AM и одном НЛ, На основании этих данных рассчитывают отношение НЛ/АМ, абсолютное число НЛ и

AM в БАЛ, общее число частиц во всех

АМ и НЛ, а также их сумму, Наиболее информативными и надежными для характеристики пульмонотоксичного действия пылевых частиц являются показатели общей клеточности, абсолютного числа НЛ, численного соотношения

НЛ/AM.

Дпя каждого из перечисленных показателей получают значения коэффициентов уравнений регрессии ()) или (2), Статистическая значимость коэффициентов полинома оценивают по критерию 1 Стьюдента, воспроизводимость данных — по критерию Кохрена, точность аппроксимации — по средней ошибке аппроксимации. Модель считают адекватной, если расчетные показатели укладываются в 957 доверительные интервалы экспериментальных данных.

При анализе уравнений регрессии учитывают не только статистически значимое отличие от нуля значения коэффициента Ь„ и его знак, свидетельствующие о достоверности, степени и знаке отличия эффекта комбинированного воздействия от алгебраической суммы эффектов каждого, а принимают во внимание направленность влияния HsoJIHpoванных факторов на оцениваемый показатель РАФ, Если один из факторов (пылей) увеличивает этот показатель, а другой снижает (т,е, коэффициенты с индексами 1 и 11 имеют один знак, а с индексами 2 и 22 — другой), то даже при значении коэффициента Ь 1, значимо не отличном от нуля, алгебраическое суммирование членов полинома соответствует в токсикологическом понимании антагонистическому действию, При разных знаках коэффициентов

Ь и Ь (соответственно Ь1 и Ь )

1 Ч1 преобладает знак линейного члена полинома, если сила соответствующего фактора не превышает величину Ь<(Ь „ ), 25

5,15697 соответственно Ь (Ь ), при большей силе фактора преобразуется знак не-: линейного члена, т,е„ в этом случае при разных уровнях и соотношениях

5 доз действие комбинируемых пылей на данный показатель может оказаться как одно-, так и разнонаправленным, Кроме того, принимают во внимание характер и физиологический (или токсикологический) смысл данного показателя. Например, если среднее число пылевых частиц в единичном AN npu комбинированной пылевой нагрузке значимо выше алгебраической суммы 15 влияний изолированных факторов на этот. показатель (т,е, коэффициент Ь > статистически значимо больше нуля), то это свидетельствует о взаимном ослаблении цитотоксического действия час- 20 тиц, т,е, не о потенцировании, а об антагонизме.

С учетом указанного определяют, по каким показателям РАФ имеет место аддитивный тип комбинированного действия, по каким — более аддитивного (потенцирование), по каким— менее аддитивного (антагонизм) или явная противонаправленность действия.

При выборе основного. типа действия 30 (в соответствии с определением этого понятия методическими рекомендациями

М3 СССР В 40-50-85) учитываются встречается ли этбт тип по наибольшему числу показателей РАФ и/или при наибольшем числе вариантов доз, а также насколько токсикологически значимы эти показатели. Отдают предпочтение тому типу действия, который выявлен по показателям РАФ, перечисленным в ка- 40 честве наиболее информативных. Вместе с тем при трактовке уравнений регрессии с учетом сделанных указаний несовпадение оценок по разным показателям РАФ является достаточно ред- 15 к им, Пример, Результаты экспери-. мента, проведенного с частицами двуокиси марганца и хромата бария, растертых до близкой дисперсности, соответствующей обычному распределению частиц по размерам в производственных аэрозолях дезинтеграции, Для обоих веществ взяты уровни до 2,5 и 5,0 на крысу Эксперимент н девяти Вариан- 55 тах комбинирования, соответствующих плану матрицу 3, проведен в шести г повторностях (т.е. в сумме на 54 животных)„ Критерию воспроизводимости

09 6 уравнение регрессии (1) отвечало по шести показателям РАФ: общая клеточность БАЛ, абсолютные числа AN и НЛ, коэффициент НЛ/AN, средний диаметр

АМ, общее число фагоцитированных частиц во всех АМ и НЛ, Для всех показателей, информативных с точки зрения оценки пульмонотоксического действия, вклад фактора Х (соответствующего двуокиси марг ганцаj выше вклада фактора Х1 (хромата бария), что дает согласованную оценку первой пыли как более токсичной, о том же свидетельствует и сравнение групп, получивших равные дозы . той или иной пыли, по показателю процента дегенерированных АМ, По всем шести показателям, кроме последнего, анализ полинома (1) выявляет

1 либо противонаправленность эффектов, либо. комбинированный эффект менее аддитивного для любых или преобладающих сочетаний доз. По последнему из указанных показателей положительный коэффициент Ь также отражает, комбинированный токсический эффект менее аддитивного, Значения коэффициентов полинома для шести показателей приводятся в таблице, В качестве примера явной противонаправленности действия хрома и марганца, дополнительно усиливаемой отрицательным значением коэффициента

Ь г, можно привести уравнение регрес-! г1 сии для среднего диаметра AN г

Y=39,3+3,75Õ„+0,51Х -2,75Х2

-О, 22Х -0)?5X х (MKM) .

Следующее уравнение регрессии (для общей клеточности БАЛ) приводится как пример комбинированного эффекта менее аддитивного при однонаправленности действия факторов (противонаправленное действие фактора Х г, т.е, двуокиси марганца, может проявиться только при дозе более чем

1,34:0,02=67 мг, которая заведомо значительно выше допустимой при интратрахеальном введении и в расчет может не приниматься).

Y=(4,01 +0,19Х,+0,06X,+1,34Xir

-0,02Х -0,79Х Х ) 10 (влет).

Как по тем же самым шссти показателям РАФ, так и еще по семи другим. (среднее число частиц в одном АИ, то

1569709

Показатель РАФ

Коэффициенты ьо

Общая клеточнасть х 10

° Число АИ х 10

Число НЛ х 10 с

НЛ/АМ

Средний диаметр АМ, мкм

Общее число фагоцитированных частиц в

БАЛ х 10

-0,79

-0,03

-0,56

-О, 07

-0,02

-0,007

-0,08

0,14

1,34

-0,016

0,99

0 58

0,06

-0,005

0,54

0,19

4,01

1,43

1,32

1,74

0,19

0,011

-0,26

-0,011

-0,22 -0,25

-2,75

39,3

0,51

3,75

26,6 9,85 -1,10 10,25 -0,67 0,65 же, в одном НЛ, соответствующая сумма частиц во всех АМ, то же, во всех

НЛ, процент AN процент НЛ, процент дегенерированных AM) получены урав5 кения регрессии (2), отвечающие условиям адекватности и воспроизводимости, Так как отличные от нуля уровни воздействия комбинировались в четырех дозовых сочетаниях, то это дает в общей сложности 52 уравнения.

При этом только восемь из них свидетельствуют,о возможности комбинированного действия более аддитивного, в остж:нных 44 случаях — явньп антагонизм (противонаправленность эффектов) или действие менее аддитивного, причем отличие от аддитивности в большинстве этчх случаев статистически значимо. 20

Таким образом, предлагаемый способ дает возможность дополнить комплекс методов ускоренной экспериментальной оценки типа комбинированного действия химическихвеществ новымметодом, адек- 25 ватным задаче такой оценки в случае малорастворимых токсичных пылей, для которого она наименее разработана в целом; сочетать специальное исследование того, как проявляется комбинирован- 30 ное действие на уровне реакции альвеолярного фагоцитоза (имеющей важнейшее значение для прогнозирования токсикокинетических особенностей комбинированного действия малорастворимых пылевых частиц, а также пульмонотоксичности такой комбинации с возможностями ускоренного прогнозирования основного типа комбинированного резорбтивно-токсического действия на 10 организм в целом, Способ основан на простых и хорошо воспроизводимых цитологических показателях и не требует дорогостоящего оборудования, а использование методов математического планирования сводит к минимуму расход, животных.

Способ сочетает свойственную клеточным тестам более широкую биологическую обобщенность оценки и высокую статистическую надежность показателей, получаемых при подсчете сотен клеточных элементов, с учетом реакции целостного организма на цитотаксическое действие пылевых частиц.

Использование изобретения позволяет сократить время исследования до одной недели (вместо 4 мес в извест- ном способе), снизить трудоемкость и повысить точность оценки типа комбинированного действия малорастворимых пылей, Формула и з о б р е т е н и я

Способ моделирования оценки типа комбинированного токсического действия малорастворимых пылей путем введения в легкие экспериментального животного исследуемых пылей с последующим излучением ответной реакции организма, отличающийся тем, что с целью повьппения воспроизводимости, исследуемые пыли вводят интратрахеально и через 24 ч проводят бронхоальвеолярный лаваж, центрифугируют и затем микроскопируют клеточный осадок, исследуют цнтологические показатели реакции альвеолярного фагоцитоэа для построения уравнений регрессии этих показателей по дозам, входящим в комбинацию веществ с учетом их взаимовлияния, причем в качестве основного выбирается тот тип комбинированного действия, на который указывают не менее 75% исследованных показателей.