Способ получения рекомбинантной плазмидной днк prh w11 или prh w12, кодирующей омега-интерферон
Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к конструированию рекомбинантных плазмидных ДНК для получения интерферонов. Плазмиду P9 A2 или E79 E9 переваривают рестриктазой AVA II, полученную вставку к ДНК переваривают SA и 3A, выделяют фрагмент длиной 189 п.о., плазмиду PER 33 переривают рестриктазами ESOR I и PVU II, фрагмент длиной 389 п.о. далее переваривают энзимом SAU 3A, выделяют фрагмент длиной 108 п.о., который лигируют с фрагментом длиной 189 п.о., полученную ДНК обрабатывают HIND III и лигируют с HIND III линсаризованной плазмидой ER 103, полученной рекомбинантной ДНК трансформируют штамм E.COLI HB 101, полученную при этом плазмиду PRHW 10 переваривают BAM H 1, инкубируют в присутствии фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 и четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, плазмиду обрабатывают энзимом NCO I, выделяют большой фрагмент NCO I - ALUI плазмиды P9 A2 или E79E9, который получают в результате обработки плазмиды AVA II с последующим гидролизом N CO I и ALU I, рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют E.COBI HB 101.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ (СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
„„SU„, 157241 (51) 5 С 12 N 15/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н ПАТЕНТУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4202100/30-13 (62) 3935002/28-14 (22) 09.03.87 (23) 31 . 07.85 (31) P 3505060, 8 (32) 14, 02.85 (33) ПЕ (46) 15,06.90. Бюл. 11 - 22 (71) Берингер Ингельгейм Интернациональ ГмбХ (DE) (72) РудольФ Гауптманн, Петер Иейндль
Эва Растль-Дворкин, Гюнтер Адольф, Петер Светлы, Кристиан Пилер (AT) и Норберт Гауэль (DE) (53) 575.224.2:577.2 (088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ
ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pRHW11 или pRHW12, КОЦИРЛ)БЕЙ ONEГА-ИНТЕРФЕРОН (57) Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к конструированиюрекомбинантных плазмидных ДНК для получения интерферонов, Плазмиду р9А2 или Е79Е9 переваривают рестриктазой Ava II, полученную
Изобретение относится к генетической. инженерии, в частности к конструированию экспрессионных плазмид для получения интерферонов, а именно к способу конструирования экспрессионных плазмид pRHW11 и pRHW12, кодирующих новые интерФероны.
Способ осуществляют следующим образом, Человеческую В-лимфомную линию клеток, например Namalma-клетки, 2 ставку K ДНК переваривают Sa и ЗА, выделяют Фрагмент длиной 189 п.о., плазмиду pERÇÇ переваривают рестриктазами EcoR I H Pvu II фрагмент длиной 389 п.о..далее переваривают энзимом Ба и ÇA, выделяют фрагмент длиной 108 п.о., который лигируют с Фрагментом длиной 189 п.о., полу-( ченную ДНК обрабатывают Н1пй III u лигируют с Hind III линеаризованной плазмидой ER 1 03, полученной рекомбинантной ДНК трансформируют штамм
Е. coli НВ 101, полученную при этом плазмиду pRHW 10 переваривают Bam Hl, инкубируют в присутствии фрагмента
Кленова ДНК-полимеразы 1 и четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, плазмиду обрабатывают энзимом Nco I выделяют большой фрагмент Nco I — - Alu I плазмиды р9А2 или Е79Е9, который получают в результате обработки.плазмиды Ava II с последующим гидролизом
Nco I u Alu I, рекомбинантной плазмидой Д1К трансформируют Е, coli
НВ 101, 1 табл. обрабатывают вирусом, например Sendai-вирус. Выделяют образовавшуюся из стимулированных Namalwa-клеток мРНК и используют ее в качестве матрицы для синтеза кДНК, Чтобы повысить выход специфических для интерферона последовательностей в процессе клонирования, мРНК-препарат разделяют в сахарах с градиентом плотности соответственно на различной длины индивидуальные мРНК-молекулы, 1 572419
Предпочтительнее собирать (накапливатт) мРНК в области около 12S (примерно 800 — 1000 оснований мРНК).
В этой ообласти седиментирует специфическая для сС - и Ь -интерферонов
5 мРНК. мРНК из этой области градиентов концентрируется благодаря осаждению и растворению в воде.
Составление библиотеки кДНК осуществляют изве-тными методами. мРНК снабжают добавкой олиго-dt ° Затем благо— даря добавке четырех дезоксинуклеозид— трифосфатов(ИМАТР, dGTP, dCTP, dTTP) и фермента обратной транскриптазы в соответственно буферированном растворе в течение 1 -, при 45 С синтезиру-, о ют кДНК, Благодаря экстракции хлороформом и хроматографии на колонке с гелем, например через сефадекс G50, 2п очищают гибрид кДНК/мРНК. РНК гидролизуют благодаря обработке щелочью (0,3 моль NaOH при 50 С, 1 ч), и кДНК после нейтрализации с помощью кислого раствора ацетата натрия 25 осаждают этанолом. После добавки дезоксинуклеозидтрифосфатов и F.,coli
ДНК-полимеразы-1 в соответствующий раствор осуществляют двухнитевой; (двойной) синтез, причем ДНК служит одновременно как матрица и как затравка благодаря образованию структуры
I типа шпильки на своем 3 -конце (6 ч о при 15 С), После экстракции фенолом, хроматографии на сефадексе G50 и осаждения этанолом ДНК в пригодном растворе подвергают обработке специфической эндонуклеазой S I, При этом распадается структура шпильки, а также непревращенная в двойную нить ДНК, д0
После экстракции хлороформом и осаждения этанолом двухнитевую ДНК . (ds ДНК) разделяют по величине в сахарах с градиентом плотности. Для следующей стадии клонирования пред- 45 почтительно применяют только ds ДНК размером 600 bp и более„ чтобы повьсить вероятность получения клонов„ которые содержат комплектную кодирую-. щую последовательность новых интер4 эонов. ds ДНК длиной более 600 bp концентрируют из градиентов путем осаждения этанолом и растворения в ваде.
Для того, чтобы увеличить образо55 вавшиеся ds ДНК-молекулы, их нужно сначала внести в соответствующий вектор, а затем в бактерию Е.coli. Вектор представляет собой плазмиду pBR
322. Эта плазмида состоит из репликона и двух селекционных маркеров, Они придают хозяину резистентность против антибиотиков ампициллина и тетрациклина (Ар, Тс ) . Ген для Р -лактамазы и (Ар )содержит последовательность для .распознавания рестрикционной эндонуклеазы Рз I. рВЕ 322 можно разрезать с помощью Pst I. Выступающие
3 -концы удлиняются с помощью концевого фермента дезоксинуклеотидтрансферазы (TdT) при помещении dGTP в соответственно буферированный раствор ° Одновременно также на 3-концах удлиняется ds ДНК с помощью фермента TdT при применении dCTP. Гомополимерные концы плазмиды и ds IIFIK смешивают в соответствующих концентрационных соотношениях и при пригодных условиях температуры, солевых и буферных условиях.
Е, coli штамма НВ 101 (генотип Р-, hsds 20 (r B„ m В) rec A13, ara-14, proA2, 1acV1, galK2, rpsL12O (Smr), xyI-5, mt1 — 1, зпрЕ44, lambda †) обрабатывают путем выращивания в СаС1 °
Компетентный Е. coli НВ 101 смешивают < с ДНК и после инкубации при 0 С трансформируют полученной плазмидной ДНК путем теплового нагрева при 42 С в течение 2 мин. Затем трансформированные бактерии помещают на содержащие тетрациклинагаровые пластинки (10 мкг на 1 мл). На этом arape могут расти только Е. coli НВ 101, которые восприняли векторную или рекомбинантную векторную молекулу (Тс ) . Рекомбинантные вектор-d ДНК вЂ молеку передают
5 хозяину генотип Ар ТС, так как благодаря введению ds ДНК в (3 -лактамазуген разрушается информация для Р -лактамазы. Клоны переносят на агаровые пластинки, которые содержат 50 мкг/мл ампициллина. Растет только примерно
ЗЯ, что означает, что.97Х клонов содержат вставку dsgHK-молекулы. Из них
28600 клонов переносят индивидуально в лунки (выемки) пластинок для микротитрования, которые содержат питательную среду, 10 мкг/мл тетрациклина и глицерина, После того, как клоны увеличиваются в них, пластинки о хранят при -70 С (кДНК-библиотека).
Клоны после размораживания переносят на нитроцеллюлозные фильтры, Эти фильтры расположены на содержащем тетрациклин питательном агаре. После
15724 ) 9 увеличения колоний бактерий ДНК бактерии фиксируют на фильтре.
В качестве образца служит предпочтительно вставка клона pER33, которая содержит ген для IFN-g — 2-Arg, Благодаря никтрансляции этот кусок ДНК радиоактивно маркируют, причем применяется ДНК-полимераза I, dATP, dGTP, dTTP и о Р-dCTP Нитроцеллюлозные фильтры при пригодных нестрогих условиях гибридизации предварительно прежде всего обрабатывают без добавки радиоактивного образца и затем гибридизируют примерно в течение 16 ч при добавке радиоактивного образца.
После этого фильтры промывают также в нестрогих условиях. Благодаря низкой строгости (точности) гибридизации и промывки охватывают не только со- 20 держащие интерферон-ф.2-Arg-клоны, но также другие интерферонсодержацие клоны, последовательности которых могут заметно отклоняться от последо-. вательностей до сих пор известного ин- 25 терферона-К. После высушивания фильтры экспонируют на рентгеновской пленке. Почернение, которое четко находится над уровнем фона, показывает наличие клона со специфическими ин. — Зп терферону последовательностями.
Так как.сигналы радиоактивности имеют различное качество. то положительные клоны. попозреваемые как положительно реагирующие клоны, выращива- 35 ют в маленьком масштабе. Плазмидную
ДНК-молекулы изолируют, переваривают с рестрикционной зондонуклеазой Pst I и разделяют по размеру электрофоретически на агаровом геле (геле агарозы) 40
ДНК в геле агарозы (агаровом геле) по методу Саутерна переносят на нитроцеллюлозный фильтр. ДНК этого фильтра гибридизируют с помощью радиоактивного, содержащего IFN-ген, денатуриро- 4 ванного образца. В качестве положительного контроля служит плазмида
IF7 (хранится в DS M под номером 2362), содержащая ген для интерферона -2arg. Ауторадиограмма четко показывает что клон F76E9 и клон Р9А2 содержат последовательность, которая гибридизируется при нестрогих условиях с помощью гена интерферона с6 -2-Arg, Для того, чтобы подробнее охарактеризовать ds ДНК-вставку клона Е76Е9 и клона Р9А2, плазмиды этих клонов приготовляют в большем масштабе. ДНК переваривают различными рестрикционными эндонуклеазами, например с AluI, iSau 3A, Bg III, Hinf I, Pst I u
;Нае III ° Образовавшиеся фрагменты
,разделяют в агаровом (агарозном) геле. Благодаря сравнению с,соответствующими маркерами величин, например с фрагментами, которые образуются путем переваривания pBR 322 с рестрикционной эндонуклеазой Hlnf I> соответственно HaeIII, определяют размеры фрагментов. Определяют последовательность этих фрагментов. Сделан вывод, что в случае вставки клонов, Е76Е9 и Р9А2 речь идет о до сих пор неизвестных интерфероногенах, а именно о омега-интерферонах.
Информацию об омега-интерферонах используют для того, чтобы переварить кДНК-ставку с рестрикционными эндонуклеазами. Образовавшиеся фрагменты лигируют в ds ДНК-форму (репликативная форма) М13 тпр9 и секвенсируют с помощью дидеокси-метода Sanger. Однонитевую ДНК рекомбинантных фагов изолируют. После связывания синтетического олигомера в четырех отдельных приготовлениях осуществляют двухнитевые синтезы при применении большого фрагмента ДНК-полимеразы 1 из
Е.coli (фрагмент Кленова). В каждой из четырех частичных реакций добавляют один из четырех дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddATP; ddCTP; ddCTP;
ddTTP). Это приводит к статистически распределенным обрывам цепи в тех местах, на которых в матрице ДНК находится дополнительное к соответствующему дидезоксинуклеозидтрифосфату основание. Кроме того, дополнительно используют радиоактивно маркированный
dATP. По окончании реакции синтеза продукты денатурируют и однонитевые
ДНК-фрагменты разделяют по величине в денатурирующем полиакриламидном геле. После этого гель экспонируют на рентгеновской пленке. Из ауторадиограммы можно определить ДНК-последовательность рекомбинантного И13 фага °
Последовательность вставки различных рекомбинантных фагов определяют с помощью пригодной компьютерной программы.
Изолированная кДНК клона Е76ЕД для омега (Glu)-интерферона длиной 858 ( пар оснований имеет 3 -нетранслированную область. Область, которая кодирует зрелый омега (Glu)-интерферон, 1572419 доходит от нуклеотида 9 до нуклеотида 524. Изолированная кДНК клона
Р9А2 для омега (Glu)-интерферона длиной 877 пар оснований, кодирующая
5 зрелыи омега-интерферон, доходит от нуклеотида 8 до нуклеотида 523. 3—
Нетранслированная область в случае
Р9А2 доходит до поли-А-отрезка (участка) .
ДНК-последовательность, кодирующая омега-интерферон, полностью содержится в клонах Е76Е9 и Р9А2. Они начинаются на N-терминальном конце аминокислот цистеин-аспарагиновая кис.лота — лейцин. Оба зрелых омега-интерферона имеют длину 172 аминокислоты, что четко отклоняется от длин обоих известных интерферонов, например
166 (соответственно 165).аминокислот 20
-в случае с4 -интерферонов. Оба оме1
Характеристика Омега Альфа
Длина протеина в аминокис166
172 лотах
Потенциальное место N-гликозилирования в положении
%
Интерферон альфа-Л имеет только
)65 аминокислот.
Интерферон альфа-Н имеет потен3(. М циальное место для N-гликозилирования в положении 75. лизат бактерий после его роста испытывают в тесте сокращения пятна.
Однако гены. экспрессируются в
45 плазмиде экспрессии рЕК 103, так как этот вектор содержит-все регуляционные элементы, которые приводят к высокой скорости экспрессии клонированных генов. Согласно изобретению в плазмиде pBR 322 более короткий
EcoRI/Bam HI-фрагмент заменен ДНКпоследовательностью формулы
Sau3A
EcoRI
gaattcacgct САТСССТААААСАТТСТССАААААСАСССТТСАСТТТСССТТССССА 59
)mRNA-Start
ACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAGCTÒAAAG ATG 116
RBS HindIII
E. coli HB 101 с плазмидой Е76Е9 и E. cali 101 с плазмидой Р9А2 депонированы (3.7.1984) в немецкой коллекции микроорганизмов (Е S N Gottingen) под номером DSN 3003, соответственно DSN 3004, Для доказательства того, что вновь найденные клоны продуцируют подобную интерферону активность, например культивируют клон Е76Е9, и га-интерферона обладают потенциальным участком N-гликозидирования в положении 78 аминокислот (аспарагин-метионин-треонин).
Сравнение ДНК клона Е76Е9 и клона
Р9А2 показывает различие. Кодирующий аминокислоту ill триплет в клоне
Е76Е9 представляет собой GAG и кодирует глутаминовую кислоту, в то время как этот триплет в клоне Р9А2 представляет собой GGG и кодирует глицин.
Оба омега-интерферон-протеина поэтому различаются одной аминокислотой и обозначаются как омега (Glu)-интерферон (Е67Е9) и омега (Glu)-интерферон (Р9А2) .
Ф
Сравнение обоих омега-интерферонов с до сих пор известным человеческим о -интерфероном дает следующую картину (см.таблицу), 15724
Cys Asp
TGT GAT С
Sau3A
IFN — omega — Cen —
I, Получение необходимых для этой цели отдельных фрагментов ДНК.
Фрагмент а.
Для получения фрагмента а плаэмиду, которая содержит ген для IFN-oMeга, например плазмиду Р9А2, перева5 10 15
His Gly Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leu CNcoI САТ GGC CTA СТТ AGC
AGG ААС АСС TTG 28
20 25 30
Val Leu Leu His Gln Ые Arg Arg Ile Ser Pro Phe Leu Cys Leu
СТС 73
Gly
GGG 118
Ыей
CTG САС САА АТС AGG AGA АТС ТСС
35 40
Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gln
AGA AGA GAC ТТС AGG ТТС ССС CAG
50 55
Leu Gln Lys Ala His Val Met Ser
ATG I63
Ala
TTG САС AAG GCC CAT GTC ATG ТСТ
65 70
Gln Ile Phe Ser Leu Phe His Thr
Leu Gln
Glu Arg Ser Ser
CAG АТС ТТС AGC СТС ТТС САС АСА
80 85
Asn Met Thr Leu Leu Asp Gln Leu
ССТ ?08
His
GAG CGC ТСС ТСТ
His Thr Gly Leu
CTG CAG
Ala Trp
GCC TGG ААС ATG АСС СТС СТА САС САА СТС САС АСТ GGA СТТ CAT 253
95 100 105
Gln Gln Leu Gln His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gln Val Val Gly
CAG САА CTG САА CAC CTG GAG АСС TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 298
110 1 15. 120
Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala Т1е Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu
GAA GGA GAA ТСТ GCT GGG GCA АТТ AGC AGC ССТ GCA CTG АСС TTG 343
125 130 135
Ar Ar Tyr Phe Gln Gly .Ile Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys
AGG AGG ТАС ТТС CAG GGA ATC CGT GTC ТАС CTG AAA CAG AAG AAA 388
140 145 150
Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Met Glu Ile Met Lys
ТАС AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA АТС ATG AAA 433
155 160 165
Ser Leu Phe Leu Яег Thr Asn Met Gln Glu Arg Leu Arg Ser Lys
ТСС TTG ТТС ТТА ТСА АСА ААС. ATG САА GAA AGA CTG AGA AGT ААА 478
Asp Arg Asp Leu Gly Ser Ser
GAT AGA GAC CTG GGC ТСА ТСТ TGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA 530
GTG СТТ
Lys Asp
AAG GAC
Ser Gln
AGC CAG
19 10 ривают с рестрикционной эндонуклеазой Avail. После хроматографии и очистки полученной кДНК-вставки ее переваривают с рестрикционными эндонуклеазами N coI u Alul двукратно и после этого иэолируют с помощью хроматографии и электроэлюирования.
Этот фрагмент содержит большую часть соответствующего омега-интерфероногена.
Так, например, омега (Gly)-интерфероноген клона Р9А2 имеет следующую структуру:
ССТ ТТС TTG TGT
Glu Met Val Lys
GAG ATG GTA ААА
Ual Leu His Glu
GTC СТС САТ GAG
1572419
ТААСАСТТССАСАТСТС.ACTCTGCTCAATTCAAAACACTCTTATTTÑÑÑÑÒÒÒAÀÒÑÀÑ 589
AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCÑAÑÒËÒÀÒÑÒÒÀ 648
AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTAÒÒÒÒÒÀÑÒÑÀÒÒÒÀÒ 707
TIATTCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAAСАААТСТТТССС 766
TTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGct
802
AluI
Фрагмент б вставки ее переваривают далее с рест15 рикционной эндонуклеазой SauÇA и желательной длиной 189 bp фрагмент изолируют с помощью хроматографии и электроэлюирования. Он имеет следующую структуру:
Для получения фрагмента б плазмиду Р9А2 переваривают с рестрикционной эндонуклеазой AvaII. После хроматографии и очистки полученной кДНК5 10 15
Asp 1.eu Pro Gln Asn His Gly Leu 1.eu Ser Arg Азп Thr Leu
Sau3A САТ СТС ССТ CAG AAC САТ GGC СТА СТТ AGC AGG ААС АСС TTG
20 NCOI
25 30
Val Leu Leu His Gln Net Arg Arg Ile Ser Pro Phe Leu Cys Leu
CTG САС САА ATG AGG AGA АТС ТСС ССТ ТТС
35 40
Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Net Val
ТТС TGT СТС 87
Lys Gly
АСА АСА САС ТТС AGG ТТС ССС CAG САС ATG
50 55
Leu Gln Lys Аlа His Val Net Ser Val Leu
GTA AAA GGG 132
His Glu Met
ACG CAG ТТС САС AAG GGC CAT GTC АТС ТСТ GTC СТС САТ GAC ATG 177
Leu Gln Gln Ile
CTG CAG CASau3Ag atc
189
Фрагмент с..
Для получения фрагмента с плазмиду pER 33 двукратно переваривают с рестрикционными ферментами EcoRI u
PvuII. Полученный после фракционирования на агаровом (агарозном) геле и очистки фрагмент длиной 389 bp, ко-, торый содержит Trp-промотор, рибоЯаиЗА
EcoRI
gaattcacgct САТСССТААААСАТТСТССАААААСАСССТТСАСТТТСССТТССССА 59
ACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAÑÑÒÒÀÀÀÑ АТС 116
RBS Hind III
Cys Asp
TGT gate
Sau3A
123
GTG СТТ
Lys Asp
AAG GAC
Ser Gln сомальное место связывания и стартовый (инициирующий) кодон, затем переваривают с SauÇA. Желательный фрагмент длиной 108 bp получают путем электрофореза на агаровом (агароз- ном) геле, электроэлюирования и очистки на колонке Elutip. Он имеет следующую структуру:
15724 19
Hind III
Sàu3A ЫСОI а AGCTTAAAC ATGTGTGATC TGCCTCAGAA CCATGGCCTA CTTAGCAGGA
ACACCTTGGT GCTTCTGCAC CAAATGAGCA GAATCTCCCC TTTCTTGTGT
CTCAAGGACA GAAGAGACTT CAGGTTCCCC CAGGAGATGG TAAAAGGGAG
CCAGTTGCAG AAGGCCCATG TCATGTCTGT CCTCCATGAG ATGCTGCAGC
100
150
200
AGATCACACA TCTTTAagct
Sau3A Hind III
5 - AGCTTAAAGATGTGT 3
3 — АТТТСТАСАСАСТАСр 5
Лигирование фрагментов б и с.
Фрагменты б и с лигируют Т4-лигазой и после разрушения фермента разЭтот необходимый для получения плазмиды pRHW10 ДНК-фрагмент можно также приготовить путем применения двух синтетически полученных олигонуклеотидов:
Олигонуклеотид формулы
АССТТАААСАТСТСТ-3 оставляют дефосфо †. рилированным на своем 5 -конце. (25
Олигонуклеотид формулы 5 -.
GATCACACATCTTTA — 3,киназирует на 5— конце с помощью T — полинуклеотидкиназы
4. и ATP. При гибридизации обоих олиго, нуклеотидов получают следующий короткий 30
ДНК-фрагмент:
Благодаря этому на конце образуется типичный для Hind III 5-переход и на другом конце — типичный для Sau3A
5-переход.
Фрагмент б дефосфорилируют при при-40 менении фосфотазы из телячьего кишечника. Фрагмент б и вышеописанный фрагмент собирают вместе и связывают друг с другом с помощью Т4-лигазы.
Так как лигазе необходим по край- 45 ней мере один содержащий 5 -фосфат конец, можно связать только кусок синтетической ДНК с фрагментом б или два синтетических фрагмента по их
Sau ЗА-концам. Так как оба полученных в результате фрагмента различаются по своей длине, их можно разделять путем селективного осаждения изопропанолом. Таким образом, очищенный фрагмент фосфорилируют с помощью Т(полинуклеотидкинаэы и ATP.
Пример 2.
II.,Ïoëó÷åíèå экспрессионных плазмидв резают с помощью Hind III ° Этот лигированный фрагмент имеет следующую структуру: ! а. Получение плазмиды pRHW10, Линеаризируют экспрессионную плазмиду pER 103 с помощью Hind III u затем обрабатывают фосфатазой телячьего кишечника. После изолирования и очистки таким образом полученную ДНК дефосфорилируют и после этого лигируют с помощью лигированных фрагментов б и с (после их переваривания с Hind III). Затем Е. coli
HB 101 трансформируют полученной после лигирования смесью и культивируют на ЬВ-агаре плюс 50 мкг/мл ампициллина. Обладающая желательной структурой плазмида получила название
pRHW10, которая после его репликации служила в качестве промежуточного продукта для получения дальнейших плазмид.
1 б. Получение плазмиды pRHW12.
К разрезанной с помощью Bam Hl плазмиде pRHV10 добавляют фрагмент
Кленова ДНК-полимеразы 1 и 4 дезокси-,, нуклеозидтрифосфата, Полученную после . инкубации линеаризированную и снабженную тупыми концами плазмиду очищают и затем разрезают с помощью Ncol.
Больший фрагмент, который получается с помощью электрофореза на агаровом (агарозном) геле, электроэлюирования и Elutip-очистки по типу элюированяя, лигируют с помощью фрагмента а. Затем смесь после лигирования трансформируют в Е. coli HB 101 и культивируют на !.В-агаре плюс 50 мкг/мп ампициллина. Обладающая желательной структурой плазмида получила название pRHW12, 1 л полученной таким образом инкубированной бактериальной культуры гоптическая плотность .0,6
6 при 600 нм).содержит 1 10 международных единиц интерферона.
157241
45 в. Получение плазмиды pRHW11.
К разрезанной с помощью Ham Hl плазмиде pRHW10 добавляют фрагмент
Кленова ДНК-полимеразы 1 и 4 дезок, синуклеозидфосфата. Полученная после
5 инкубации линеаризированная» снабженная линейными концами плазмида очищается и затем разрезается с помощью
NcoI. Больший фрагмент, который получается с помощью электрофореза в агарозном геле, электроэлюирования
m E1utip-очистки (по типу элюирования), лигируется с помощью полученного аналогично из плазмиды Е79Е9 фрагмента а, в котором лишь кодирующий III аминокислоту — (Gly) GGG-кодон заменен на GAG-кодон (Glu). Затем полученной после лигирования смесью трансформируют Е ° coli НВ 101 20 и культивируют íà LB-агаре. Обладающая желательной структурой плазмида
Получила название pRHW11. pRHW11 экскретирует желательный омега-(Gly)-интерферон, 25
Пример I. Нахождение специфических к IFN-последовательности клонов. а. Приготовление кДНК-библиотеки. мРНК из стимулированных вирусом 30
Sendai-клеток прйменяют в качестве исходного материала для приготовлеНия кДНК-банка по известным из литературы методам. Образовавшиеся 30000 клонов переносят индивидуально в углубления (лунки) пластин для микротитрования, Используют следующую среду для роста и замораживания колоний: 10 r триптона," 5 г дрожжевого экстракта; 5 г NaC1; 0,51 г цитрата 40 натрия Х 2 Н О; 7,5 r К НРО 2 HgO;
1,8 г КН РО, 0»09 r MgSO4 ?Н О»
0,9 г (НН» ) 1 л. Для микротитрования пластины с индивидуальными клонами инкубируют О в течение ночи при 37 С и затем хранят при -70 С. б. Гибридизирующая проба (образец).;0 В качестве исходного материала гибридизирующего образца служит рекомбинантная плаэмида pBR 33, Эта плазмида содержит кодирующую область для зрелого интерферона IFN-2 arg плюс 190 оснований 3 -нетрансляцированной области. 20 мкг реЕ 33 инкубируют в течение 1 ч при 37 С с 30 ед. Hind III рестрикционной эндонуклеаэы в 9 16 200 мкл реакционного буфера (10 мМ трис-НС1 рН 7; 10 мИ MgC1, 1 мИ дитиотрейтода (ДТТ);50 MM NaC1). Реакцию прекращают добавлением 1/25 объема 0,5 M этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и прогревают при 70 С в течение 10 мин, После добавления 1/4 объема 5х буфера (80% глицерина; 40 мИ трис-.уксусной кислоты, рН ?; 8; 50 мМ ЕДТА, 0,05Х додецилсульфата натрия (SDS) 0,1Х бромфенолового синего) образовавшиеся фрагменты разделяют по величине в 1Х-ном агарозном геле (гель-буфер и электродный буфер (ТВЕ): 10,8 г/л трис-гидроксиметиламинометана (трис-основания); 5 5 г/л борной кислоты; 0,93 г/л ЕДТА). После инкубации геля в растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл ) участок геля, который содержит фрагмент ДНК с геном IFN (длиной примерно 800 Ьр)» вырезают. ДНК электроэлюируют в 1/10х ТВЕ-буфере. Раствор ДНК экстрагируют однократно фенолом и четырехкратно эфиром и ДНК осаждают добавлением 1/10 объема 3 M ацетата натрия (Na AC), pH 5,8, и 2,5 объемами этанола при -20 С. Осадок о ДНК промывают однократно 70%-ным этанолом и высушивают в течение 5 мин в вакууме. ДНК растворяют в 50 мкл воды (примерно 50 мкг/мкл). Эту ДНК метят методом перемещения разрыва: 50 мкл реакционной смеси содержит 50 мИ трис-НС1; рН 7,8; 5 мМ МдС1, 10 мМ меркаптоэтанола; 100 нг ДНКвставки pER 33, 16 нг DNaSeI; 25 мкм dATP; 25 мкм d GTP; 25 мкм dTTP; 20 мкС1 10 -Р)-d CTP (более 3000 Ci/ ммоль), а также 3 ед. ДНК-полимеразы 1 (Е. coli). Реакцию проводят при 14 С в течение 40 мин. Реакцию заканчивают добавлением 1 объема раствора, содержащего 50 мМ ЕЭТА» 2% ЯЭЯ; 10 мИ трис-НС1, рН 7,6, и прогревают при ?О С в течение 10 мин. ДНК отделяют путем хроматографии через сефадекс G 100 в ТЕ-буфере (10 мМ трисНС1, рН 8,0; 1 мМ ЕДТА) от невключенной радиоактивности. Радиоактивно меченный образец (проба) имеет. удельную активность примерно 4 х х10 срм/мкг. Т в. Скрининг клонов на содержание вставок гена IFN. Вмороженные в микротитр-пластины бактериальные культуры оттаивают (а). Кусок нитроцеллюлозного фильтра соот15724 ветствующего размера (размер пор .0,45 мкм) помещают íà LB-агар (ЬВагар:10 г/л триптона; 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaC1 15 г/л бакто-агара; 20 мг/л тетрациклин5 НС I ) . С помощью приспособленного к микротитропластинкам штампа индивидуальные клоны переносят на нитроцеллюлозный фильтр ° Бактерии выра- 10 щивают в течение ночи при 37 С до больших (диаметром примерно 5 мм) колоний. Для разрушения бактерий и денатурирования ДНК нитроцеллюлозные фильтры помещают по очереди на стопку пропитанных следующими растворами фильтров из ватмана ЗММ:I — на 8 мин в 0,5 М NaOH- 2 — на 2 мин в 1 M трис-НСI, рН 7,4; 3 — на 2 мин в 1 M трис-НСI, рН 7,4, и 4 — на 20 4 мин в 1,5 M NaC1, 0,5 M трис-HCI, рН 7,4, Фильтры высушивают на воздухе и затем выдерживают 2 ч при 80 С. Предварительную обработку фильтров о осуществляют в течение 4 ч при 65 С 25 в растворе для гибридизации, состоящем из бх SSC (Iх SSC соответствует 0,15 M NaC1, 0,015 M тринатрийцитрата, рН 7,0), 5 х раствора Денхардта (lх раствор Денхардта соответствует 30 0,02X PVP (поливинилпирролидон).; 0,02% FicoII (молекулярный вес 40000D 0,02% BSA (альбумин бычьей сыворотки) и 0,1% SDS (додецилсульфата натрия). На фильтр берут примерно 1 10 срм 6 пробы, приготовленной согласно (б), денатурируют кипячением и добавляют в гибридизационную смесь. Гибридизацию проводят в течение 16 ч при 65 С. Отмывку фильтра осуществляют 40 при 65 С четырехкратной промывкой в течение 1 ч в буфере Зх SSC/OIX SDS. Фильтры высушивают на воздухе, покрывают тонкой пленкой и экспонируют на пленке Кодак Х-Omats. 45 Пример 2. Перенос по Саузерну для подтверждения наличия IFN-гена в рекомбинантных плазмидах. Из колоний, дающих положительный сигнал при радиоавтографии, выращи- 50 вают культуры объемом 5 мл в течение ночи при 37 С в LB-среде (IO г/л триптона; 5 г/л дрожжевого экстракта; 5 г/л NaC1; 20 мг/л тетрациклина х НСI). Плазмидную ДНК выделяют-по 55 Birnboim u Do1y. 1,5 мл суспензии клеток центрифугируют и суспендируют при 0 С в 100 мкл.лизисного расто вора, состоящего из 50 мМ глюкозы; 19 18 10 мМ ЕДТА; 25 мМ трис-НСI, рН 8,0, и 4 мг/мп лизоцима. Инкубируют 5 мин при комнатной температуре, добавляют 2 объема-охлажденного льдом раствора (0,2 M NaOH u IX SDS), инкубируют еще 5 мин, затем добавляют 150 мкл охлажденного льдом раствора ацетата калия, рН 4,8, и инкубируют в течение 5 мин. Образовавшийся осадок отделяют на центрифуге, Раствор ДНК экстрагируют 1 объемной частью смеси фенола с СНС1 (1: l) ДНК осаждают добавлением 2 объемов этанола. После осаждения на центрифуге осадок в пробирке промывают однократно 70%-ным этанолом и высушивают в течение 5 мин в вакууме. ДНК растворяют в 50 мкл (ТЕ)-буфера, 10 мкл полученного раствора добавляют в 50 мкл реакционного буфера (10 мМ трис-НСI, рН 7,5; 10 мМ М@С1 ; 50 мМ МаС1, 1 мМ ДТТ), переваривают вместе с 10 ед. PstI-рестрикционной эндонуклеазы в течение 1 ч при 37 С. Затем добавляют 1/25 объема 0,5 М ЕДТА; 1/4 объема о 5х буфера, прогревают 10 мин при 70 С ДНК разделяют электрофоретически в 1% — ном агарозном геле (TBE-буфер). ДНК из агарозного геля по методу Саузерна переносят на нитроцеллюлозный фильтр. ДНК в геле денатурируют в течение 1 ч раствором 1,5 M NaC1! /0,5 М NaOH, Затем в течение часа нейтрализуют раствором 1 М трис х HCI рН 8 (1,5 M NaCI).ÄÍÊ переносят в 10х SSC (1,5 М NaCI; 0,15 M цитрата натрия; рН 7,0) на нитроцеллюлозный фильтр, После полного переноса (примерно 16 ч) фильтр быстро споласкивают в бх SSC-.áóôåðå, затем высушивают на воздухе и после этого прогревают о в течение 2 ч при 80 С. Затем фильтр . о обрабатывают при 65 С в течение 4 ч с помощью бх SSC/5x раствор Денхардта/0,1% SDS. Примерно 2 10 срм гибридизационной пробы денатурируют нагреванием до 100 С и затем вносят в раствор для гибридизации. Продолжительность гибридизации составляет 16 ч при 65 С. Пример 3. Обнаружение интерфероновой активности в клоне Е76Е9. 100 мл культуры клона Е76Е9 выращивают в LB-среде (см, пример 2) при o 37 С до оптической плотности А = 0 8. Бактерии отделяют на центрифуге в течение 10 мин при скорости 7000 об/мин, промывают однократно 19 157241 раствором 50 мМ трис х НСI, рН 8,0, 30 мМ 5аС1, суспендируют í 1,5 мл промывочного раствора. Инкубируют с 1 мг/мл лиоцима при 0 С в течение о получаса, бактериальную суспензию 5 пятикратно замораживают и оттаивают. Остатки разрушенных клеток осаждают путем центрифугирования в течение 1 ч при 40000 об/мин. Надасадочную жидкость стерильно отфильтровывают и испытывают на интерфероновую активность. В качестве теста применяЮт бляшку редукционного теста с V3клетками и вирус Vesicular Stomati- 15 tis. Клон продуцируют до 9000 IV 1,международных едициц) ннтерферана на. 1 л исходной культуры. Пример 4. Получение экспрессивной плазмиды pRHW12 и экспрессивной плазмиды pRHWII. а. Получение плазмиды pRHWIO. 100 мкг плазмиды Р9А2 гидролизуют со 100 ед. рестрикционной эндонуклеазы Avail, После гидролиза фермент Инактивируют путем нагревания при 70 С и полученные фрагменты разделяо ют в 1,47.-ном агарозном геле с ТВЕбуфером соответственно размеру. Полосу, которая содержит всю кДНК-встав- 30 ку, электроэлюируют и очищают на Elutip-колонке. Из полученных 20 мкг 6 мкг далее гидролизуют с рестрикционной эндонуклеазой $апЗА (20 ед. в 100 мкл раствора). фрагменты разделяют в 2Х-.íoì агарозном геле в ТВЕ-буфере. После окрашивания с помощью этидийбромида (EtBr) электроэлюируют кусок ЦНК длиной 189 bp и очищают аналогично описанному, 40 Для того, чтобы ген интерферона связать с промотором, местом связывания рибосомы и стартовым кодоном, соответствующий кусок ДНК изолируют из экспрессирующей плазмиды pER 33. 45 Для этой цели 50 мкг pER 33 двукратно гидролизуют рекстрикцианными ферментами EcoRI и PvuII, полученные фрагменть1 фракционируют соответственна их размеру в 1,4Х-ном агарозиом геле в ТВЕ-буфере. Кусок ДНК длиной 389 Ър, который содержит Trp-промотор, место связывания рибасомы и стартовый (инициирующий) кодаи, электроэлюируют и очищают с помощью El«ipколонки. Полученный фрагмент затем гидролизируют с Sau3A и получают требуемый фрагмент длиной 108 bp путем электрофореза в агарозном геле, элект20 роэлюирования и очистки на колонке Elutip с выходом примерна 100 нг. 20 нг фрагмента лигируют при 14 С в течение 18 ч с 20 нг фрагмента с в объеме 40 мкл при применении 10 ед. Т -лигазы в растворе, который содержит 50 мМ трис-НСI, рН 7,5; 10 мМ NgClg, I мМ DTT u I мМ АТР, Затем фермент инактивируют путем наго ревания до 70 С и полученную ДНК разрезают Hind III в объеме 50 мкл. 10 мкг экспрессивной плазмиды pER 103 линеаризируют с помощью Hind III в объеме 100 мкл. Инкубируют 2 ч при о 37 С, добавляют 1 объем 2-фосфатазного буфера (20 мм трис-НСI, рН 9 2, 0,2 мМ ЕДТА) вместе с 1 ед. фосфатазы телячьего кишечника (CIP). После 30 мин при 45О С добавляют следующую единицу CIP и инкубируют еще раз в течение 30 мин. Полученную таким образом ДНК очищают двукратной фекальной экстракцией, однократной экстракцией CHCI у, осаждают добавлением 1/10 объема 0,3 М ацетата натрия (рН 5 5) и 2 5 объемам этанала 100 нг линеаризированного pER 103 и лигираванных фрагментов 5 и с (после Hind III-гидролиза) вносят в 100 мкл раствора, содержащего лигазный буфер, и лигируют при 14 С в течение 18 ч с помощью Т4-ДНК-лигазы. 200 мкл компетентной Е. coli НВ IOI смешивают с 20 мкл легирующей смеси и инкубируют в течение 45 мин на льду. Затем поглощение ДНК полностью прекращают тепловь|м нагревом в течение 2 мин при 42 С. Суспензию клеток инкубируют 10 мин на льду и наносят на LB-агар, содержащий 50 мг/л ампициллина. Из полученных 24 колоний выделяют плазмидную ДНК по методу Birnboim u Doly. После гидролиза с различными рестрикционными ферментами плазмида имеет желательную структуру. Она получила название pRHWIO, б. Получение плазмиды,pRHW12. Примерно 10 мкг плазмиды pRHWIO разрезают Bam HI, затем добавляют фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I.u 4 дезоксинуклеозидтрифосфата и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. Полученную линеаризированную плазмиду с тупыми концами очищают фенольной экстракцией и осаждением спиртом. После этого разрезают рестрикционной эндонуклеазой NcoI в 419 22 100 мл бактериальной культуры инкубируют до оптической плотности 0,6 при 600 нм в минимальной среде М9, которая содержит все аминокислоты за исключением триптофана (20 мкг/мл на аминокислоту); 1 мкг/мл тиамина; 0,2К глюкозы и 20 мкг/мл индол-(3)актиловой кислоты (IAA), индуктор триптофан-оперона. Затем бактерии осаждают путем центрифугирования (1О мин при 7000 об/мин), промывают однократно буфером 50 мИ трис-НС1, pH 8; 30 мИ NaCl, суспендируют в 1,5 мл этого же буфера. Инкубируют в течение 30 мин с 1 мг/мл лизоцина на льду, бактерии 5 раз замораживают и оттаивают. Обломки клеток удаляют центрифугированием в течение 1 ч при 40000 об/мин. Надосадочную жидкость стерильно фильтруют и испытывают на интерфероновую активность в анализе по методу уменьшения пятна при применении человеческих А549 клеток и Encophalomyocarditis-вируса. Результат. I л приготовленной бактериальной культуры содержит 1 .10 6 международных единиц интерферона. Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК рКН4 11 или рВНК12, кодирующей омега-интерферон, включающий обработку плаэмиды Р9А2 или Е79Е9 эндонуклеазой Ача11, вьделение вставки кДНК, обработку полученного фрагмента эндонуклеазой БаиЗА с последующим вьделением фрагмента размером 189 п.о., обработку плазмиды энзима- ми EcoRI и Pvull, обработку полученного фрагмента размером 389 л.о., содержащего trp-Промотор, место рибомного связывания и .стартовый кодон, эндонуклеазой Sau3A, вьделение фрагмента размером 108 п.о., лигирование полученного фрагмента с фрагментом размером 189 п,о. с помощью ДНК-лигазы, обработку полученной плазмидной ДНК эндонуклеазой Hindlll, де— фосфорилирование, лигирование полученных фрагментов, трансформирование рекомбинаитными плазмидными ДНК штамма бактерий Е. coli HB 101, культивирование штамма, вьделение плазмиды pRHWl0, обработку плазмиды pRHW10 эндонуклеазой Bam HI, инкубирование в присутствии фрагмента Кленова ДНКполимеразы 1 и четырех дезоксинукле21 1572 объеме 100 мкл, Больший фрагмент получают путем электрофореза в агарозном геле, электроэлюирования и очистки на Elutip. Фрагмент 0 получают путем гидролиза 4 мкг Avail-фрагмента, который 5 содержит Р9А2-кДНК-вставку, с Ncol u AluI гричем получают примерно 2 мкг фрагмента. В последней стадии лигирования фраг-,0 мент O и добавленный к нему двукратно гидролизованный BamHI/Ncol рИИ10 лигируют в объеме 10 мкл, причем каждой ДНК используют по 10 нг. Лигирование достроенного Ватп 15 HI-сайта рестрикции Alul дает снова Bam HI-сайт рестрикции. ! Полученной после лигирования смесью трансформируют компетентные 20 клетки Е. coli НВ 101 аналогично описанному. Из полученных 40 колоний выбирают одну, она получила название pRHW12. Плазмиду изолируют и EcoR I/Bam 25 Hl-вставку секвенируют дидезоксиметодом..Плазмида имеет ожидаемую последовательность. в. Получение плазмиды рКНЧ11, Осуществляют аналогично примеру 30 p o p м у л а и з о б р е т е н и я 4б. 1 мкг плазмиды pRHW10 гидролизуют Bam HI.-Острые концы полученных ДНК делаются тупыми с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимераэы 1 и 4 дезоксинуклеозидтрифосфатов, затем линеаризированную ДНК разрезают с 35 помощью Ncol. Больший фрагмент получают электрофорезом в агарозном геле, электроэлюированием и колоночной хроматографией по типу элюирования. 40 NcoI-AluI-фрагмент выделяют из клона Е76Е9 аналогично примеру 4б. Затем 10 нг векторной части лигируют с 10 нг кДНК-части в объеме 10 мкл в соответствующих условиях и при применении 1 ед. Т4-лигазы. Полученной смесью ДНК трансформируют Е. coli HB 101. Селекцией полученных 45 колоний на содержащих ампициллин LB-чашках выбирают клон, который обозначают pRHW11, Выращивают соответствующий клон, вьделяют плазмидную ДНК. Ее структуру подтверждают наличием нескольких специфических мест разреза . рестрикционной эндонуклеазой (Alul, EcoRI, HindIII, NcoI, PstI). r. Экспрессия интерфероновой активности клетками Е. coli HB 101, содержащими плазмиду pRHW12. аАССТТАААС ATGTGTGATC TGCCTCAGAA ССАТССССТА CTTAGCAGGA ACACCTTGGT ССТТСТССАС CAAATGAGGA GAATCTCCCC TTTCTTGTGT СТСААССАСА GAAGAGACTT CAGGTTCCCC САССАСАТСС TAAAAGGGAG CCAGTTGCAG AAGGCCCATG TCATGTCTGT CCTCCATGAG ATGCTGCAGC 100 150 200 АСАТСАСАСА ТСТТТАаасаа БаиЗА HindIII l лнгирование полученного фрагмента с фрагментом NcoI-AluII плазмиды Р9А2 или Е79Е9, полученные путем переваривания плазмиды зндонуклеазами, обраI ! CA7 GGG СТА C77 AGC AGG AAC ACC 77G Ncol GTG СТТ CTG САС CAA АТС AGG АСА АТС ТСС ССТ ТТС TTG TGT СТС ботку полученной вставки кДНК энзинами Ncol H AluI со следующей нуклеотидной последовательностью: 73 AAG САС AGA AGA GAC ТТС AGG ТТС ССС CAG GAG ATG GTA ААА GGG 118 AGC CAG TTG. CAG AAG GCC САТ GTC ATG ТСТ СТС СТС САТ GAG ATG 163 СТС САС САС ATC ТТС AGC СТС ТТС САС АСА GAG CGC ТСС ТСТ GCT 208 GCC TGG AAC ATG АСС СТС СТА GAC САА СТС САС АСТ GGA СТТ CAT 252 САС САА CTG CAA САС СТС GAG ACC ТСС TTG CTG CAG GTA GTG GGA 298 САА GGA GAA ТСТ ССТ GXG GCA АТТ AGC AGC ССТ GCA CIG АСС TTG 343 AGG AGG ТАС TTC CAG GGA ATC CGT GTC ТАС CTG AAA GAG ААС ААА 388 ТАС АСС САС ТСТ ССС ТСС САА СТТ СТС АСА АТС САА АТС АТС ААА 433 ТСС TTG ТТС ТТА ТСА АСА AAC ATG САА САА AGA CTG AGA AGT ААА 478 САТ AGA GAC CTG CGC ТСА ТСТ TGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA 530 TAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCT TATTTCGG CTTTAATCAC 589 AGAATTGACTGAATTAGTTGTCCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGÑÑÀGÒÀÒÀÒÑÒÒÀ 648 AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTÒÒÀÑÒÑÀÒÒÒÀÒ 707 ТТАТТСТТАСАТТТТАТСАТАТТТАТАСТАТТТАТАТТСТТАТАТААСАААТСТТТССС 766 TTTACATTGTATTAACATAACAAAACATCTTCAGct 802 AluI 1 где Х вЂ” нуклеотид С или А, рекомбинантной плазмидной ДНК с посхроматографии, лигирования и трансфор- ледующим выделением целевого продукта. мации штамма бактерий Е. coll. НВ 101 Составитель Н, Кузенкова Редактор N. Петрова Техред М.Дидык Корректор Н. Король Заказ 1524 Тираж 49,8 Подписное РчИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-иэдательскии комбинат "Патент", r .Yæãoðoä, ул. Гагарина,101 23 .157241 озидтрифосфатов, обработку эндонуклеазой Ncol с последующим выделением большего фрагмента плазмиды pRHM10, 1 HindIII SauA Ncol 9 24 которая в Hindlll-сайте плазмиды pER 103 содержит ДНК фрагмент со следующей нуклеотидной последовательностью:
