Способ конструирования гена интерлейкина-2 человека

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСГ1У БЛИН (51) 5 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЭОБРЕТЕНИ

К А 6ТОРСНОМУ СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ОРИ ГКНТ СССР (46) 07.05.91. Бил. 1в 17 (21) 4382438/13 (22) 19.02.88 (71) Всесоюзный нлучно-исследователь-. ский институт молекулярной биологии (72) А.H.Ñèíÿêîâ, Н.К,Данилюк, О.И.Серпинский н И.А.Урманова (53) 575 ° 224 ° 2; 577 ° 2/048(088.8) (56) ЕР У 017000, С 12 N !5/00, 1987 (54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ГЕНА ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к молекулярной биологии и генетической ишкенерии. Целью изобретения является упрощение Способа. Разработан химико-ферментативный способ синтеза гена интерИзобретение относится к молекуляр-, ной биологии и биотехнологии, конкретI но к получению рекомбинвнтных ДНК ° содеравщих полные гены биологически активных веществ, методами генетичс"кой инженерии, и мовет найти применекие в биотехнологии при создании, роммов - продуцентов целевых продуктов, Целью изобретения является упрощение способа.

Для достижения цели разработан способ синтеза гена интерлейкина-2 человека, заключающийся в синтезе 16 частично комплементврных полинуклеотндов длиной 30-40 нуклеотидных звеньев, попарной репаратнвной достройке их до полных дуплексов с помощью ДНКполимераэы (фрагмент Кленова) с последующим клонированием какдого иэ четырех фрагментов в ппазмидах pFHI23

„.SU„„) 554 2

2 лейкина-2 человека, заключающийся в том, что синтезирует 16 частнчно комй- .лементарных полинуклеотндов длиной 30-40 нуклеотаднмх звеньев, которыя. затем попарно достранваот до Ilolllant дуплексов с помощью ®IK полимераз1ю (фрагмент Кленова) с последующим клонированием кащдого вэ четырех фрагментов в плаэмндах рРН123 н pFHI24, способных давать субфрагменты с вронеВольно з&плаиироввннмйн липкнмн концами после гидролнза рекомбннантной

ДНК эндонуклеазой рестрикции Fok E, направленно собирают поЛученные фрагменты ДНК гена П.-2 я плазмиде pFHI25.

1 табл, 3 и pFHI24, способных давать субфрвгменты с произвольно запланированном

"липкими" концами после гндролиза рекомбинвнтной ДНК эндонуклевзой рест- в а рикции Fok E последующей сборке полученных еубфрагментов в плаэмиде Щ

pFHI25, в9

Существенным отличием в предложен- ф р ном конструировании являетСя использование синтетических частично комт-. плементарных полинуклеотидов длиной

30-40 нуклеотндных звеньев, позволяющих не, синтезировать полный дуплекс гена EL-2 н тем саммю предоставляющих воэмохность экономить ЗОХ работы по химическому синтезу целевого rasa, д, Существенным отличием является твкхе использование для клонирования Н получения субфрагментов плвзмид

pFHI23 и рРН124, что позволяет однозначно собрать целевой ген из субфрагI 554 IH ментов с заранее запланированными

II II линк ими концлми, r

Н р и м е р I, Химический cuuTeз г1олииуклептидов.

5 (:витез проводят твердофлзным фосфотриэфирным методом, В качестве носителя используют модифицированное стекло пористое CP(: †10, Наращивание олигонуклеотидной цепи проводят от 3 — к 5 -концу с помощью динуклеозпддифосфатных производных (MeO) TrNp (PhC?)Np(PhCT). Выделение полевого продукта после деблокирования реакционной смеси проводят путем последовательных хроматографий нл ),ichrosI7rb RP18 сначала и

0,1 М тризтиламмопийлцетлте в градиенте лцетонитрила 15-40 . Затем раст-. вор выделенного триэтилполинуклеотидл упариплют досуха, растворяют в

2,5 мл 80 -ной водной уксусной кислоты и выдервивают при комнатной температуре 45 мин ° Раствор упаривлют досуха, pacTBopsloT остаток в 25

1 мп дистиллированной воды и хроматогрлфируют нл Lichrosorb RP18 в 0,05 И триэтиллммонийацетате в,градиенте лцетонитрила 5-20, 30

Дуплексы для клонирования фрагмеитл ? получают из полинуклеотидов (Т.-IV) (таблица) . Для этого реакционную смесь, содержащую по )00 пмоль меченного у-Р АТР полинуклеотида

З

35 (I) н фосфорилированного холодным

ATP полинуклеотида (II) в 100 мкл буфера I (60 мМ трис-НС1, рН 7,5, lO мИ МВС11, 10 мИ 2-мвркаптоэтанол), нагревают 10 мин при 50 С, охлаждают 0 до 20 С, добавляют dNTP до концентрации 250 мкИ и 10 ед. ДНК-полимерлэы

1 (фрагмент Кленова). Реакционную

О смесь инкубируют 30 мин при 20 С.

f?HK дуплекс оса сдаюT ацетоном, со- 45 держащим 2Х ?.1С?О, промывают спиртом, сущат на воздухе, осадок раст" воряют в воде, ПолученнъN дуплекс расщепляют 50 ед, эндонуклеазы рестрикции PstI в 200 мкл буфера 2 (20 мМ трис-НС1, рН 7,8, 10 мМ ИвС1, 50

10 мИ 2-меркаптоэтанол), содержащего

О

50 мИ НаС1, в течение 3 ч при 37 С.

Аналогично получают дуплекс иэ полинуклеотидов (III и IV) ° который расщепляют обработкой 60 ед, эндонуклеазы рестрикции Влт HI в 200 мкл буфера 2, содержащего 100 мМ NaC1 в

О течение 12 ч при 37 С, Оба рестрикгл выделяют с помояп,ю гол> -злектрофорезл в Я, IIAAI, Реакционную гмесь, содержащую по

2 пигаль приготовленных дуплексoB и

0,25 пмоль векторной NIK, полученной из рН1124 совместным рлсщеплением эндонуклелз рестрикции liam Н?(50 мкл раствора, содержащего буфер 2 и

100 мМ М((С) z, при 37 С 1 ч) и Pst ? (50 мкл буфера 2 и 50 мМ ИлС1 при

37"Г I ч), обрлблтывают 8 ел. ЛНК лиглзы флга-Т в 30 мкл буфера 3 (20 мМ трис-II(;), рН 7,5, 10 мМ ИцС1, 10 мМ

2-меркаптоэтанол и 0,25 мИ A>III) в течение 16 ч при 10 С, Реакционную смесь используют для трансформации клеток F..coli JM103. Суспензию клеток после трансформации высевают на 1,5 ный агар, содер клкгий 50 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл Х-gal. Из колоний „ имеющих lлс Z -фенотип и гибридизую— щихся с Р .-меченными зондами, выдеЗг ляют щелочным методом ДНК, которую дополнительно анализируют с помощью

Hsp I, Fco RI u Pst I-гидролиэл, Структуру рекомбинантной ДНК pFL!41 подтг1ер кдлют модифицированным методом

Иаксама-Гилберта, Бактерии F, col i JM I 03, с оде ркащие пллзмнды pF),)41 со вставкой требуемогп размера, выращивают в 100 мл Lll- среды. Для получения целевого субфрагмента I, кодирующего часть гена человеческого IL-2 с заранее запланированными липкими концами, 60 мкг

ЛНК пллэмиды pFL141 в 300 мкл буфера

1 и 50 мИ NaC1 обрабатывают 30 ед, эндонуклеазы рестрикции Pst I 1 ч при

37 Г, а затем 30 ед. эндонуклеазы рестрикции Fok I в тех ее условиях

Целевой фрагменТ длиной 100 нуклеотидных пар выделяют с помощью электрофореза в 5 ПААГ, П р е р 2, Получение ДНК субфрагментл II, кодирующего аминокислотную последовательность, соответствующую 32-60 аминокислотам человеческого IL-2.

Аналогично примеру 1 иэ полинуклеотидов (Ч-VIII) фрагмента II получают дуплексы для клонирования, После репаративной достройки полинуклеоти" дов (Ч и Ч?) в описанных вьпне условиях полученный дуплекс обрабатывают

50 ед, эидонуклеазы рестрикции Sal G? в 2(70 мкл буфера 1, содерщвщего

I50 мМ ЯлС1 в течение 12 ч при 37 Г, 1 554382

Bsp I, Есо RI u Pst эндокуклеаэ рестрикции. Структуру полученной рекомбинатной ДНК pFL137 подтверждают методом Максама-Гилберта, Колонии,, имеющие плазииды рИ.137

5 со вставкой требуемого размера, выращивают в 100 мл LB-среды, Для получения целевого субфрагмента IV c sapaнее запланированными "липкими" конца» 10 ин 60 мкг ДНК плаэмиды pFL137 s

300 мкл буфера l, содержащего 150 мИ

NaGl, обрабатывают 60 ед, эндонуклеаэы рестрикции Sel GI 3 ч при 37 С, Реакциоинув смесь осакдавт 2Х ным раствором ЫСЩ, Промывают этиловым спиртои, сушат. Остаток растворяют в !

00 мкл буфера l, содержащего 50 иМ

NeC1 и гидролиэувт 40 ед. зндонукле« аэы рестрикции Fok I 1 ч при 37 С.

Целевой фрагмент длиной 120 нуклеотндных пар выделяют, с помощью электрофореэа в 5Х ПААГ, Пример 5. Получение гена человеческого IL-2 в составе плаэмнды 25 рРН125.

5 икг плазииды рРН125 гидролиэуют последовательно рестриктаэой Sel GI в 50 мкл буфера 2, содержащего 150 мИ яас1 ° 1 ч прн 37ОСФ затем рестрик- 30 таэой Pst I.â 50 мкл буфера 2 и

50 иИ йаС1 в тех же условиях. Сиесь иэ 0,5 пмоль Рst I - Sal. GI векторной

ДНК и по 5 пиоль I II III IV субФрагиента (примеры 2 ° 3, 4 5 соответ-35 ственно), взятых в зквимолярных соотношениях, обрабатывают 15 ед. Т ДНКлигаэы в описанных выше условиях

10 икл смеси используют для трансформации компетентных клеток F..coli 3N)0340

Иэ колоний, гибрндиэующихся с Р -ие- ченными олнгонуклеотидаин II u IV фрагментов, выделяют ДНК н анализируют ее с помощью Bsp I, Pst I, Есо

RI зндокуклеаэ рестрикции. Структуру 45 рекбмбинантной ДНК, содержащей синтезированный ген IL-2 и обозначенной

pIL-2, подтверждают модифицированным методом Максама-Гилберта. П р и и е р 6. Определение биоло гической активности синтезированного гена IL-2.

1 икг ДНК плаэинды pIL-2 гидролиэуют рестриктазой Pst I в описанных выше условиях. ДНК осаждают ацетоном, содержашнм 2Х. 1.iCLO» высушенный осадок растворяют в 30 мкл буфера 1, добавляют 5 ед..ДНК-полимеразы 1 (фрагмент Кленова) н выдерживают 15 мин при 20 Г, Реакционную смесь прс г> о вают 2 мин при 70 Г, добавляют АТФ до концентрации 100 мкМ, 5 ед, ЛНК лнгаэы и инкубируют 12 ч при 5 Г, 2 мкл реакционной смеси используют для трансформации клеток F..coli ЗМ83.

Иэ колоний, имеющих lас 7. -фенотип и гибридиэующихся с Р =меченными зондами на 11.-2, вццеляют ДНК, обозначенную pEXIL-2,. которую анализируют с помощью Bsp I, Pst I-гидролиза, Активность рекомбинанткого IL-2 была оценена по количеству включенного (h тимндина в ДНК первичной культуры клеток иышинкых лиифоцитов. в соответствии с иэвестмыч методом.

Клетки Е.coli ЗЙ83, содержащие

pEXIL-2,выращивают в 5 ил ЬВ-среды при 37 С до li66O1,5. Клетки собирают центрифугированием, затеи ре. суспендируют в 7 ил среды ХЕНКС, содержащей 1.мгlмл лизоцима, и выдеркивают 30 мин при 5 С. Смесь трижды эамораживают, озвучивают и центрифугируют. Супернатант фильтруют через "Nillipore" фильтр (0,2 мкм)

100 икл клеточного супернатанта 2-го разведения, добавляют к 100 мкл индуцированной клеточной культуры (посевая концентрация 5-8 0 клеток

-5 (ил) н териостатирувт 24 ч при 37 С в

;,тиосфере 5Х СО 0,25 мкКи зН-тииидина вводят в реакционную смесь н термостатируют еще 4 ч в тех ае услови" ях. Клетки собираются на фильтре

"Nillipore" (0,45 икм), промывают

0,01 М К НРО (рН 7,5) с О,l М йаС1 °

Количество включенного ЗН-тимидина измеряют по Черенкову, используют счетчик Nark III.

Лизаты клеток E.coll JM83, содершащие pFXIL, достоверно вызывают пролиферацию мышиных лимфоцитов, т.е, обладают активностью IL-2. Полученные данные свидетельствуют о биологической полноценности синтезированного гена человеческого IL-2, Предлошенный способ получения гена

IL-2 имеет существенные преимущества, Вследствие применения на стадии получения субфрагиектов длинных частичнб коиплементарных полинуклеотидов и использования репаративной дострой,ки их до полных дуплексов, удается значительно сократить работу llo химическому синтезу и выделению нуклео- тидного материала, Разбивка гена на субфрагменты дает .воэиошкость отдель5 1554

Дуплекс, полученный иэ полинукле отидов (VII и VIII), расщепляют обработкой 50 ед, эндонуклеаэы рестрикции

Bg1 II в 200 мял буфера 1 ° содержащего

50 мМ ИаС1, в течение 12 ч при 37 С, Оба рестрикта выделяют с помощью гельэлектрофореэа в 8/ ПААГ.

Реакционную смесь, содержащую по

2 пмоль приготовленных дуплексов и

0,25 пмоль векторной ДНК, полученной иэ рРН)24 совместным расщеплением эндонуклеаэами рестрикции Bam I u Sal GI (условия приведены выше) обрабатывают 8 ед. ДНК-лиэагы в описанных вьппе условиях, Лигазной смесью трансформируют клетки Е.coll JM)03. Из коло4 ний, имеющих 1ас 7. -фенотип, гибридиэующихся с 3 P-меченными зондами, выделяют ДНК и дополнительно анализи. 2р руют ее с помощью Вар I, Есо RI u

Pst I-гидролиэа. Структуру рекомбинантной ДНК pFL подтверждают иодифицированным методом Максаиа-Гилберта, Бактерии F..coli, содержащие плаэ- 25 миды pFI.581 со вставкой требуемого размера, выращивают в 100 LB-ñðåды. Для получения целевого субфрагмента II с заранее запланированными

"липкими" концами 60 мкг ДНК плаэми- 30 ды pFL58) в 300 мкл буфера 1, содержащего 50 мМ NaC1, обрабатывают

40 ед, эндонуклеаэы рестрикции Fok I

l ч при 37 С. Целевой фрагмент дли- .. ной 87 нуклеотидных пар выделяют с помощью электрофореэа в 67 ПААГ.

Пример 3. Получение ДНК субфрагмента III, кодирующего аминокислотную последовательность, соответствующую 60-98 аминокислотам челове- 4р ческого П.-2..

Аналогично примеру 2 из полинуклеотидов (IX-XII) субфрагмента III получают дуплексы для клонирования, После репаративной достройки полинук- 46 леотидов (IX и X) в описанных вьппе условиях полученный дуплекс обрабатывают 50 ед, эндонуклеазы В81 II в

200 мкл буфера 1 ° содержащего 50 мМ

NaCl в течение !2 ч при 37 С. Дуплекс, полученный из полинчклеотидов (XI и XII), расщепляют обработкой

100 ед, эндонуклеаэы рестрикции

Sal GI в 200 мкл буфера 1, содержащего 150 иМ NaCl ° в течение 12 ч при

37 С, Оба рестрнкта выделяют с помощью гель-электрофореза в 8Х ПААГ. ... Реакционную смесь, содержащую по 2 пмоль приготовленных дуплексоп

382 6 и 0,25 пмоль векторной ЛНк, полученной из pFH)23 совместным расщеплением эндонуклеаэами рестрикции Bam Н1 и Sal GI (условия приведены выше), обрабатывают 10 ед. ДНК-лигазы в описанных выше условиях, Лигаэной смесью трансформируют клетки Е.coli ЛМ)03, Иэ колоний, имеющих lас

7, -фенотип, гибридиэующихся с Ð-иеченными зондами, выделяют ДНК н дополнительно аналиэируют ее с помощью .

Вар I, Есо RI u Pat-гидролиза, Структуру рекомбннантной ДНК pF!.912 подтверждают модифицированным иетодом

Максама-Гилберта, Колонии, имеющие плазмиды pFL912 со вставкой требуемого размера, выращивают в 100 мл LB-среды. Для получения целевого субфрагмента Ш с зара» нее запланированнымн "липкими концами 60 мкг ДНК плазмиды pFL9)2 в

300 икл буфера I, содержащего 50 мМ

NaC1, обрабатывают 40 ед. эндонуклеаэы рестрикции Fok I 1 ч при 37 С. Це левой фрагмент длиной 1!8 нуклеотндных пар выделяют с помощью электрофореэа в 5Х ПААГ.

Пример 4. Получение ДНК субфрагмента IV которая имеет аминокислотную последовательность, соответствующую 98-133 аминокислотам человеческого IL-2, Аналогично примеру 2 из полинуклеотидов (XIII-XVI) субфрагмента IV получают дуплексы для клонирования, После репаративной достройки полинуклеотидов (XIII и XIV) в описанных выше условиях полученный дуплекс обрабатывают 40 ед. эндонуклеазы ре» стрикции Sau ЗА в 200 мкл буфера 1 ° содержащего 50 мМ ЯаС1, в течение о

12 ч при 37 С. Дуплекс, полученный иэ полинуклеотидов (XV и XVI) расщепляют эндонуклеазой рестрикции Sal GI в описанных выше условиях, Реакционную смесь, содержащую по

2 пмоль приготовленных дуплексов и

0,25 пиоль векторной ДНК, полученной иэ pFH)23 совместным расщеплением эндонуклеазами рестрикции Bam HI и ASal GI {условия приведены выше), обрабатывают 3 ед, Т4 ДНК-лигазы в описанных вьи е условиях. Лигаэной смесью трансформируют клетки. К.coll

JMl03, Hs колоний, имеющих lас Е -фенотип, гибридиэующихся с Р -меченнъии зоидаин выделяют ДНК и Дополнительно анализируют ее с поиощьв

1554382 ет возможность получения разнообраз" ных лйллогов природного гена IL-2, но очистить их методом молекулярного клонирования и пллэмидах pFH123 и pFMI24, наработать в достаточном количестве и после гидролиза эндонуклеаэой рестрикции Fok I выделить суб5 фрагменты с уникальными липкими концами, способными направленно собираться в целевой ген IL-2. Такой прием позволяет избежать трудоемкого и ненадежного последовательного лигировлния коротких олигонуклеотидов в полный дуплекс гена II.-2, Такой подход не накладывает ограничений на использование определенных 1> кодов аминокислот. Это является дополнительным преимуществом способа, позволяющим осуществи ть направленную замену кодонов аминокислот, редко используемых у прока йот, Синтезирован- gp ный ген может эффективно экспрессироваться как в прокариотических, так и в эукариотических векторах, Наличие промежуточных субфрагментов гена

IL-2 с уникальными липкими концами 25 на*но само, по себе, так клк открываФормула изобретения

Рекомбинлнтнля пллэмиднл

Структура полинуклеотида

Номер фрагмента

Номер олигонуклсо тида

СССТГСАГССССТАСТТСААССТСТАСАААСААА

ТАААТГСТССАГТТГСАГСТГТСТТТТСТТТСТА

CTGCTGGATTTACAGATGATTITGAATGGAAT

ССГГАТГСТТСТААТТАТТААТТССАТТСААА

ССГТCGACAAGAATСССАААГТСАССАСААТ

АТСТААААСТТАААТСТГАС CATTCTGGTGA

GCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCT

СССАГАТСТСТАААСАГТСААСАТСТТТСА

CCCAGATCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAAGAAGTG

GAAAATTTTTGCTTTGTGCTAAATTCAGCACTTCTTCCAG

АСТТАССТССССТССАСТТААТСТССААТАТСААССТААТ

CCTGTCGACCCTTCAGTTCCAGTACAATTACGTTGATA

CCTGATCAGGGTTCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATG

TTCTACAATGGTTGCTGTCTCATCAGCATATTCACACAT

ТТТСТСААСССТТССАТТАССТТТТСТСАААССАТТАТТ

ССТГТССАСТСАТТААСТСАСТСТТСАААТААТССТТТС

Составитель Т.Забойкииа

Техред М.Ходанич Корректор О.Кравцова

Редактор Л.Павлона

Заказ 2298/ Тираж 386 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раущская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул, Гагарина, 101

II

III

IV

Ч

VI

VII

VIII

IX

Х

XI

XII

XIII

XIV

XV

XVI

Способ конструирования гена интерлейкина-2 человека, предусматривающий синтез гена интерлейкина-2 человека и утем ферментативной свивки сос тавляющих его фрагментов и субклониронание гена в состане пллзмидной ДНК, отличяющийся тем,что,с целью упрощения способа, фрагменты получают иэ частично комплементариых полинуклеотидов при попарной их реплративной достройке до полных дуплексов с помощью ДНК-полимеразы

I Е.coli-фрагмента Кленова с последующим клонированием полученных дуплексов в составе плаэмид pFH1?3 и рИ1! 20 и выделением фрагментов с запланированными несимметричными липкими концами с помощью эндонукМеаэы рестрикции Ро1 I, а субклонирование гена ведут в составе плазмиды рРН125, я llHK рП.-2...