Способ определения микроколичеств днк

 

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии и может быть использовано для контроля за содержанием ДНК в условиях низких концентраций полинуклеотида, в том числе при его выделении и очистке, в работах по радиобиологии при оценке повреждающих воздействий ионизирующего излучения, а также в медицине при диагностике некоторых видов заболеваний. Целью изобретения является повышение чувствительности способа определения микроколичеств ДНК при одновременном его удешевлении. Основа нового способаиспользование нового флуоресцентного красителя 2-[2-(4-оксифенил)-5(6)-бензимидазолил]-5(6)-(1-пиперазинил)-бензимидазола в условиях, оптимальных для образования специфического комплекса этого красителя сДНК. Измерение интенсивности флуоресценции (ИФ) проводят до взаимодействия красителя с анализируемой ДНК, после него и после добавки в ту же кювету раствора ДНК известной концентрации. Расчет искомой концентрации полинуклеотида осуществляют по формуле C(X)=C<SB POS="POST">ст</SB><SP POS="POST">.</SP>(N<SB POS="POST">1</SB>:N<SB POS="POST">2</SB>)<SP POS="POST">.</SP>[(ИФ<SB POS="POST">1</SB>-ИФ<SB POS="POST">0</SB>):(ИФ<SB POS="POST">2</SB>-ИФ<SB POS="POST">1</SB>)], где C<SB POS="POST">ст</SB> - исходная концентрация стандартного раствора ДНК, мкг/мл

N<SB POS="POST">1</SB> - разбавление исследуемой пробы в кювете

N<SB POS="POST">2</SB> - разбавление стандартного раствора ДНК в кювете, ИФ<SB POS="POST">0</SB> - интенсивность фоновой флуоресценции

ИФ<SB POS="POST">1</SB> - интенсивность флуоресценции окрашенной пробы

ИФ<SB POS="POST">2</SB> - интенсивность флуоресценции пробы после добавки стандартного р-ра ДНК. Предложенный метод позволяет определять содержание ДНК в растворах с концентрацией в 1,5 - 2 раза ниже, чем известные способы, использующие коммерческие флуоресцентные красители ДАФИ и Хехст-33258. Благодаря достаточно высокой специфичности нового метода он может быть с успехом применен при анализе низких концентраций ДНК в биологических материалах, в частности в плазме крови. 5 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (51)5 G 01 N 21/64, С 09 К 11/06, С 12 N 15/00

1 (21) 4381082/30-13 (22) 18.02.88 (46) 07.04.90. Бюл. Ф 13 (71) Центральный научно-исследовательский рентгенорадиологический институт и Ленинградский технологическии институт им. Ленсовета (72) С.Д. Иванов, Е.И. Фомина, В.Е. Комар, В,А.Кузнецов, А .В. Гарибаджиу и О.Ф.Гинзбург . (53) 577.2.08(088.8) (56) Brunk С.F., Cones К.С., Games Т.У;

Anal. Biochem., 1979, 92, 497-500.

Kapuscinski J., Skoczy1as В.

Anal. Biochem, 1977, 83, 252-237. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОКОЛИЧЕСТВ ДНК (57) Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии и может быть использовано для контроля за содержанием ДНК в условиях низких концентраций полинуклеотида, в том числе при его выделении и очистке, в работах по радиобиологии при оценке повреждающих воздействий ионизирующего излучения, а также в медицине при диагностике некоторых видов заболеваний.

Целью изобретения является повьппение чувствительности способа определения микроколичеств ДНК при одновременном его удешевлении. Основа нового способа — использование нового флуоресцентного красителя 2 -(2-(4-оксиФенил)-5(б)-бензимидазолил) -5(6) †(1-пипеГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ИзобрЕтение относится к области биохимии и молекулярной биологии и

I может быть использовано для контроля

„ЛО„, 1555652

2 разинил)-бенэимидаэола в условиях, оптимальных для образования специФического комплекса этого красителя с

ДНК. Измерение интенсивности Флуоресценции (ИФ) проводят до взаимодействия красителя с анализируемой ДНК, после него и после добавки в ту же кювету раствора ДНК известной концентрации. Расчет искомой концентрации полинуклестида осуществляют по

Формуле

С(х) = С, .(п, ° п )л((ИФ;ИФ,) . (ИФ -Иф )j где С вЂ” исходная концентрация стандартного раствора ДНК, мкг/мл; и разбавление исследуемой пробы в кюве- д те, n — разбавление стандартного раствора ДНК в кювете;Иф — интенсивность Фоновой Флуоресценции, Иф, — ин. тенсивность Флуоресценции скрап еннсй пробы; ИФ вЂ” интенсивность Флуоресценции пробы после добавки стандартного р-ра ДНК. Предложенный метод позволяет определять содержание ДНК в растворах с концентрацией в 1,52 раза ниже, чем известные способы, использующие коммерческие Флуоресцентные красители ДАФИ и Хехст-33258.

Благодаря достаточно высокой специФичности нового метода он может быть © с успехом применен при анализе низких @1 концентраций ДНК в биологических ма- Ю териалах, в частности в плазме крови, 5 табл.

4 содержания ДНК в условиях низких концентраций полинуклеотида, в частности, в радиобиологии при оценке пов1555652 () nI ИФ, - ИФ, ст и ИФ Иф, м ..1,, О 15

И

a) Ql +HN NH-HN КQNH2

С1 NH7, Ъ

N0

ХО

V 1V :нЗср р НИ Ф 1 2 3 СНС-М Я 1"Н2

ЫН2 1) СН,С0 11

3 1l I 102 ) Н2/NiCK - NH

111

c> w w

„ . о- (%.

Н

11Н2 С1,НЫ, ыс N р G + ",с -он-ЯK3он—

ИН2 RO ЯРН

1Х Н Ч11

R= СНЗОСН СН ,) 111+и-Л-X Х 1 I О Н н

N у) и — 1 реждающих воздействий излучения, а также в медицине при диагностике некоторых видов заболеваний., Цель изобретения — повышение чув5 ствительности и удешевление способа определения микроколичеств ДНК.

Основу предлагаемого спососба составляет использование нового Флуоресцентного красителя 2 - 2-(4-оксифинил)-5(6)-бензимидазолил)-5(6)-(1-пиперазинил)-бензимидаэола Формулы (1) в условиях, оптимальных для образова. ния специфического комплекса данного красителя с ДНК (при рН 8,1+0,6).

Флуоресцентный краситель (1) характеризуется $ = 350+2 нм и

= 460+2 нм. Измерение интенсивности флуоресценции (ИФ) проводят до(ИФ ) и после (ИФ,) взаимодействия красителя (I) с анализируемым раствором ДНК, а также после добавки в кювету раствора ДНК (ИФ2) известной концентрации. Расчет искомой концент-, 30 рации, мкг/мл, ДНК осуществляют по формуле

Чистоту продуктов контролируют ме- тодом ТСХ на пластинах Silufol-UV-254 где С вЂ” концентрация стандартной ст

ДНК, мкг/мл, n — разбавление исследуемой пробы в кювете измерения, п — разбавление стандартной

ДНК в кювете измерения, ИФ вЂ” интенсивность фоновой Флуоресценции;

ИФ< итенсивность Флуоресценции п.зобы, окрашенной (Т);

HC — интенсивность флуоресцен2 ции пробы после добавки раствора стандартной ДНК.

Предлагаемый метод позволяет определять содержание ДНК в растворах с концентрацией до 3 10 мкг/мл (нижняя граница чувствительности), что примерно в 1,5-2 раза ниже предела чувствительности для известных флуоресцентных красителей ДАФИ и

Хехст-33258. В силу достаточно высокой специфичности красителя (Q метод определения микроколичеств ДНК может бытЬ использован при анализе содержания ДНК в биологических материалах, в частности в плазме крови.

Пример 1 ° Синтез Флуоресцентного красителя (I) осуществляют по схеме в системах: А — хлороформ — метанол (9:1), Б — хлороформ — метанол — 25X1555652

5 ный аммиак (16: 4:1),  — ацетон — гексан (1:2); à — хлороформ — уксусная кислота — метанол (6:3:1).

Выход (Е) 93%. Т.пл. 0 300 С.

Найдено,7: N 410.

С24 Н22 060

Выч ислено, 7.: М 41 О, 49 .

УФ-спектр, h „, нм (1рб)в этаноле: 263 (4,49), 342 (4, 71} .

Пример 2, Определение содержания ДНК в пробе с неизвестной концентрацией предлагаемым и известным способами.

В стандартную кювету на 10 мм флуориметра (полный объем кюветы 4,0мм), содержащую 1,0 мл 0,01 N трис-буфера;

0,01 М трилона Б и 0,1 М NaC1 (рН 8,1)> добавляют 0,05 мл раствора красителя (I) до конечной концентрации

1 мкг/мл и измеряют фоновую (ИФ0) флуоресценцию (3, = 350 нм;

= 460 нм), затем добавляют

0,02 мл раствора ДНК из тимуса крысы неизвестной концентрации и снова измеряют интенсивность Флуоресценции (ИФ,), после чего вносят известное количество той же ДНК и повторяют процедуру измерения интенсивности флуоресценции (ИФ ). После внесения до2 бавок содержимое кюветы перемешивают

8-!2 с. Неизвестнук концентрацию ДНК в анализируемой пробе рассчитывают по

:,указанной формуле.

В варианте исполнения вместо кра- 35 сителя (I) используют Флуоресцентный краситель ДАФИ (3р,„„ = 450 нм), а реакцию проводят при рН 7,0.

Результаты анализа приведены в табл.1 ° 40

Из п рив еденных данных следует, что использование (I) дает достоверные результаты, близкие получаемым по известному способу (различия сос-.

45 тавляют не более OX).

Пример 3. Определение ИФ и

ЬИФ для разбавленных растворов ДНК.

В кювету, содержащую буфер (пример 2) и краситель ((I), ДАФИ или

Хехст), в конечной концентрации 19,6»

«1О мкг/мл после измерения ИФ добавляют определенное количество раствора ДНК из тимуса крысы с известной концентрацией и после перемешивания измеряют ИФ .

Зависимость ЬИФ от концентрации

ДНК в пробе, окрашенной различными красителями, приведена в табл.2.

Полученные данные позволяют заключить, что в случае применения (I) при всех концентрациях ДИК больше

0,32 10 мкг/мл величина ЛИФ прямо пропорциональна концентрации ДНК в анализируемом растворе. При концентрации ДНК ниже этого значения нарушается линейность взаимного изменения названных величин и возрастает ошибка измерения параметра Ь ИФ = ИФ— пр — ИФ,„. Вследствие этого концентрацию ДНК О, 3 1 О мкг/мл можно считать нижней границей чувствительности метода определения с помощью (I).

Кроме того, определение микроколичества ДНК при использовании красителя (I} оказывается более эффективным по сравнению с известными.

При концентрациях ДНК меньше 0,67ч

«1О мкг/мл ИФ и соответственно ЛИФ при использовании ДАФИ имеют очень низкие значения,. а использование Хехста оказывается практически невозможным.

Пример 4. Определение относительного квантового выхода для (I)

ДАФИ и Хехст 33258.

Определение проводят в буферном растворе этого же сс ставa, что в примере 1 (рН для ДАФИ и Хехста 7,2; для (I) 8,1). Конечная концентрация красителя во всех случаях 0,09 мкг/мл, воз& = 350 нм; щельz»t, -= 5 нм, щельрегы = 15 нм, для ДАФИ 1,дд

450 нм, а для Хехста 33258 и для (I) 1perucep = 460 нм.

Результаты анализа приведены в табл. 3.

Как следует из табл.3, квантовый выход предлагаемого красителя (I) в

l, 46+0, 1 2 раза выше, чем известных красителей Хехста-33258 и ДАФИ.

Пример 5. Определение зависимости ЛИФ от рН среды.

Состав буферного раствора, как в примере 1 . Концентрация красителя (Е)

1 мкг/мл. Концентрация ДНК в пробе

9,4 мкг/мл.

Полученные данные приведены в табл.4.

Иэ табл . 4 следует, ч то Д ИФ имеет максимальное и постоянное значение при рН от 7,5 до 8,7.

Пример 6. Определение содержания ДНК в биологическом материале.

Плазму крови белых беспородных мышей через 22 ч после гамма-облучения в дозе 8 г и плазму крови интякт1 555652

Таблица 1

Проба

Состав пробы

ИФ

ДИФ

He„-11ô„„ (»1 мкг/мл

1 Буфер + (I) +

+ 0,02 мл пробы +

+ ст. ДНК (6,7 мкг/мл)

2 Буфер + ВФИ +

+ 0,02 мл пробы +

+ ст, ДНК (6,7 мкг/мл) 0,135

0,278

0,400

0,235

0,330

0,420

0,143

0,122

0,095

0,090

7,70

6,94

II р и м е ч а н и е. Разбавление проводят при и, = 53,5 и и = 54,5.

Таблица 2

ИнтенсивКрасиЗначение интенсивности при конечной концентрации,мкг/мл

0 0,16» 0,32» 0,67»

«10 «) 0 «1О

1,31» 2,29» 3,84

«1О э ° «10 »10

5,33« ,10

6,07х

„l0 тель ность

14,6 16,4

1,9 3,7

12,1 l2,9

0,9 0,7

24,7 28,8

7,2 11,3

12,7 12,8

0,1

11,2 11,2

17,5 18,6

1,1

ДАФИ ИФо

ДИФ

ИФ

Хехест ДИФ (r) ИФ, ДИФ

12,9 13,2

0„2 0«5

11,2 11,3

0 0,.1

19,2 20,3

1 7 2,8

13,9

1,2

11,6

0,4

22,0

4,5

18,0 19,0

5,3 . 6„3

13,9 14,3

2,7 3,1

32,4 34,4 !

4,9 16,9, ных животных объемом 0,02-0,05 мл .без, какой-либо предварительной обработки вносят в стандартную кювету на 10 мм измерения флуориметра, содержащую

1,0 мл буфера (0,01 М трис, 0,01 М трилон Б, 0,1 М хлористый натрий . pH 8,1) и определяют интенсивность флуоресценции ИФ при Я р п = 350 нм щели „„= 5 нм вг.р = 460 м 1О щели р,,„ р = 15 нм. После этого добавляют 0,05 мл красителя (I), исходная концентрация 2 мкг/мл и измеряют ИФ«, затем в эту же кювету добавляют 0,02 мл раствора ДНК тимуса 15 крысы с известной концентрацией (3,7 мкг/мл) и определяют ИФ

Результаты измерения опытов приведены в табл.5, Измерение концентрации ДНК в плаэ- 20 ме мышей предлагаемым способом позволяет выявить известный феномен снижения уровня ДНК после облучения.

Минимальное количество ДНК, определяемое в этих. случаях в кювете, составляет для плазмы облученных мышей 0,372 мкг/мл, а для реперной ДНК

0,066 мкг/мл.

Использование изобретения обеспечит возможность осуществления быстрого, простого и экономичного анализа содержания ДНК в растворах с концентрациями в ),5-2 раза ниже, чем при использовании наиболее чувствительных из известных флуоресцентных красителей, Формула изобретения

Способ определения микроколичеств

ДНК, включающий обработку раствора полидезоксирибонуклеотида флуоресцентным красителем, определение интенсивности флуоресценции образующегося комплекса и сравнение ее с интенсивностью флуоресценции стандартного раствора ДНК, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повьппения чувствительности и удешевления анализа, в качестве красителя используют .2-(2-(4-оксифенил)-5(6)-бенэимидаэолил1-5(6) †(1-пиперазинил)-бензимидазол, а реакцик с ДНК проводят при рН 7,5-8,7.

1555652

Таблица 3

Относитель ный квантовый

Проба ютН.ед

Состав пробы

Оптическая плотность при

350 нм выход

Хехст ДАФИ (I) Хехест ДАФИ (Z) Хехст ДАФН (I) 33,1 17,7

49,7 40,0 1,91 2,00 2,67

66,4 59,5 2,11 2,29 3,36

Буфер +краситель

2 +0,125. мкг/мл ДЯК

3 +0,246 мкг/мл ДНК

0,0065 16,5

0,0055 31,5

0,0065 44,8

0,0035 0,0040

0,0035 0,0030

0,0045 0,0035

Та блиц а 4 рн

ИФ, отн.ед .

Буфер + краситель + ДНК ЬИФ

БуФер + краситель

Таблица 5

ИФ, Проба

Анализируемый материал

Объем и, и пробы

ИФ

ИФ С

2 > " п а мы расчет по формуле), мк г/мл

1 Плазма крови интактных мышей 0,02 53,5 54,5 28,6 110,0 118,0 36,9

2 То же 0,02 53,5 54,5 27,3 105,0 113,5 33,2

0,02 53,5 54,5 19,5 67,!

75,8

Плазма крови облученных мышей

То же

l9,9

I9,6

Составитель О. Скуратовская

Техред А.Кравчук Корректор Л.Бескид

Редактор Н.Бобкова

Заказ 553 Тираж 529 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Noc ква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-изцательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

7,2

7,5.

7,8

8,1

8,4

8,7

9 1

0,93

0,78

0,84

1,15

1,40

2,05

2,10

9,20

10,65

11,60

12,20.

12,60

12,10

10,90

0 05 22 0 56 0 24 0 90 4 95 3

8,27

9,87 !

0,76

11,05

I 1,20 !

0,05

8,80