Способ индукции супрессорных клеток в периферической крови людей

 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки иммунного статуса. Цель изобретения - повышение супрессорной активности клеток, ускорение и упрощение способа. У обследуемых берут кровь, выделяют лимфоциты, ресуспендируют их, инкубируют с ионофором А 23187, взятым в концентрации 5 - 10 мкмоль, в течение 5 - 20 мин. Клетки отмывают, облучают и совместно инкубируют с необработанными лимфоцитами и ФГА. Затем по включению 3Н-тимидина определяют супрессорную активность. Супрессорный эффект клеток при действии ионофора А23187 выше на 18,3 - 46,3% по сравнению с прототипом. В результате использования предлагаемого способа сокращается время анализа на 48 ч, упрощается постановка способа в сравнении с прототипом.

СО10З СОВЕТСНИХ

РЕСПУБЛИК

5 А1 аю 011 (53)5 G 01 N 33/53

1 ! с

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4467871/28-14 (22) 28.07.88 (46) 15,07,90. Бюл. У 26 (71) Институт иммунология (72) P М. Хантов, А. Г.Капинкович, Б ° В,Пинегин и К,Е;Балашов (53) 615, 375 (088,.8) . (56) Гаг ;as R,, Maur I,, К1а1шап А, Immunology, 1986, 57, р. 395-398. (54) СПОСОБ ИНДУКЦИИ СУПРЕССОРНЫХ КЛЕТОК В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЛЮДЕЙ (57) Изобретение относится к мецицине, а именно к иммунологии, я может быть использовано цля оценки имунного статуса. Цель изобретения — повышение супрессорной активности клеток, ускореИзобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано дпя оценки. иммунного статуса человека н норме и у лиц с патологией иммунной система.

Целью изобретения является ускорение индукции, повышение супрессорной активности клеток, а также упрощение способа.

Способ осуществляют следующим об-. разом.

Иэ периферической крови получают мононуклеары в градиенте плотности фиколла-нерографина, обрабатывают их кальциевым ионофором А23!87 в концентрации 5-10 мкмоль в течение 5-20 вин, отьивают клетки, облучают и определяют супрессорную активность, 2 ние и упрощение способа. У обследуемах берут кровь, выделяют лимфоциты, ресуспенцируют их, инкубируют с ионофором А 23187, взятым н концентрации 510 мкмоль, н течение 5-20 мин. Клетки отмавают, облучают и совместно инкубируют с необработанными лимфоцитами и

ФГА, Затем по включению Н-тимицина

3 опрецепяют супрессорную активность.

Супрессорный эффект клеток при цействии HoHQBopa А23187 выше на 18,346,3Х по сравнению с прототипом, В результате использования предлагаемого способа сокращается время анализа на

48 ч, упрощается постановка способа н сравнении с прототипом, Пример. Кровь яз локтевой вены здоровых цонорон н объеме 20 мп забирают и стерильные лабораторные пробир-. ки с гепарином (15 ец/мл KpoBH). Гепаринизированную кровь смешивают со средой 199 в соотношении 1:3 и наслаивают осторожно на градиент плотности фиколлнерогр афин (плотность смеси 1,0761,077),. Центрифужкае пробирки э акрынают стерильной резиновой пробкой и центрифугируют н течение 30 мин при

400g, Собранную интерфазу ("белое облачко"), содержащую мононуклеары,переносят н чистые центрифужные пробирки с помощью пастеровских пипеток, Клетс ки дважды отманают в среде 199 при

200g в течение 10 мин, После удаления надосадка клетки ресуспензируют н среФор мул а из обретения

Составитель В,Литовченко

Техред Л. Сердюкова Корректор И.Муска

Редактор Е,Копча

Заказ 1915 Тираж 512 Подпи сное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при L 1I ÍÒ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

3. 15786 де 199 в концентрации 10 /мл и и объеме 5 мп помещают в центрифужные пробирки, В пробирки вносят кальциевый ионофор А23187 (Sigma) в концентрации

10 мкмоль. Предварительно его растворяют в 70 этаноле до концентрации о

1 мг/мп и хранят при - 20 С. Рабо ые разведения А 23187 готовят на среде

199, Концентрация этанола в рабочих 1О разведениях А23187 составляет 0,05Х, Пробирки с обработанными ионофором клетками инкубируют 10 мин при 37 С при периодическом встряхивании,,посте чего трижды отмывают в избытке хо- 15 лодной среды 199 центрифугированием в течение 10 мин при 200g, Осацок после последнего центрифугирования ресуспензируют н среде культивирования (СК) следующего состава: среда ЯРМХ-1640, 20

1 0% инак тивиров анной наг рев анием феталь-. ной сыворотки, 2 MM глутамина, 4 MM

HEPES-буфера, 20 мкг/мл гентамици- на, Концентрацию клеток доводят цо

10 /мл СК, их помещают в пенициллино- 25

6 вые флаконы и облучают в дозе 2000 рад на усTcLHQHKe./Ñòåáåëü За" (CS, мощность дозы 9,7 Гр/мин), Контролем служат клетки; подвергшиеся тем же саум воздействием, за исключением обработ- 3р ки ионофором, Вместо.ионофора в пробирки добавляют среду 199, содержащую

0,05% этанола, После облучения клетки вносят в плоскоцонные 96-луночные микроплажпеты в каждую лунку по .100 мкл (10 клеток), В те же лунки вносят

35 равное количество мононуклеарон в том же объеме. СК, выделенных от аутологичных или аллогенных доноров, а также

10 мкг/мп ФГА в объеме 50 мкл. Каждую „ пробу ставят в трех параллелях, Культивирование прОводят в СО -инкубаторе во влажнбй среде, содержащей 5% СО» при 37 С. в течение 72 ч. 3а 6 ч до.

45 лунку вносят 1 мк Ки Н - тимидина в объеме 10. мк л. Клетки осаждают на фильтрах с помощью полуатоматического харвестера. Высушенные фильтры помещают в стеклянные флаконы, содержащие сцинтилляционную жидкость, приготовленную на основе толуола. Активность образцов определяют в счетчике

"Mark-III", Обработка в течение 10 минмононуклеаров кальциевым ионофором А23187 приводит к индукции клеток, способных резко подавлять РБТ на ФГА: ЛС колебался от 70,8 до 93,8%, в среднем

82,1% при исследовании аутологичной

РБТ и от 42,4 до 95,7Х, в среднем

74,1% при исслецовании аллогенных РБТ.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет значительно ускорить процесс, на 48 ч повысить супрессорную активность клеток — по

- прототипу супрессорный эффект составляет в аутологической системе 63,9Х а по предлагаемому — 82,1% в аллогенной системе, соответственно 27,8Х и 74,1%, т.е. в среднем ниже на 1 8, 3 -4 6, 3 Х, а также упростить процесс за счет использования ионофора А23187.

Способ индукции супрессорных клеток в периферической крови людей, включающий забор крови выделение лимфоцитов, инкубацию н присутствии активатора, отмывку, облучение и определение супрессорной активности, о т— ли ч аюший ся тем, что, сцелью повышения супрессорной активности клеток, ускорения и упрощения способа, в качестве активатора используют ионофор А 23187 в дозе . 5-10 мкмоль и инкубируют с ним лимфоциты в течение 520 мин.