Способ определения теофиллина в сыворотке крови

 

Изобретение относится к иммунохимии, конкретно к способу определения теофиллина в биологических жидкостях и может быть использовано для лекарственного мониторинга при терапии теофиллином: контроль за концентрацией препарата в организме больных, подбор индивидуальных доз для повышения эффективности терапии и устранения токсических явлений. Целью изобретения является повышение чувствительности и ускорения способа. Измерение теофиллина в сыворотке крови основано на конкуренции между теофиллином из пробы и теофиллином, связанным с твердой фазой азосвязью в антителами к теофиллину, меченными пероксидазой. Для анализа необходимо несколько мкл сыворотки или плазмы крови (достаточно капли крови из пальца), длительность анализа 30 проб составляет около 40 мин, чувствительность метода равна 0,01 мкг/мл теофиллина.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) SU (II> (1) С 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4340647/28-14 (22) 22.12.87 (46) 23.06.90. Бюл. У 23 (7 1) Всесоюзный научно-исследовательский институт "Биотехнология" (72) P.Г.Василов, H.Ï.Данилова и Н.И.Бекман (53) 612.015(088.8) (56) Рекламный проспект фирмы

А11erpenefics. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕОФИЛЛИНА

В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (57) Изобретение относится к иммунохимии, конкретно к способу определения теофиллина в биологических жидкостях, и может быть использовано для лекарственного мониторинга при терапии

Изобретение относится к области иммунохимии, конкретно к способу определения теофиллина в биологических жидкостях, и может быть использовано для лекарственного мониторинга при терапии теофиллином: контроль за концентрацией препарата в организме больных, подбор индивидуальных доз для повышения эффективности терапии и устранения токсических явлений.

Цель изобретения — повышение чувствительности и ускорение способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Для иммунизации используют коньюгированный антиген теофиллина с белком, имеющий следующую структуру: (тео-аэо-БСА) 2 теофиллином: контроль за концентрацией препарата в организме больньж„ подбор индивидуальных доз для повышения эффективности терапии и устранения токсических явлений. Целью изобретения является повышение чувствительности и ускорения способа. Измерение теофиллина в сыворотке крови основано на конкуренции между теофиллином из пробы и теофиллином, связанным с твердой фазой аэо-связью с антителами к теофиллину, меченными пероксидазой.

Для анализа необходимо несколько мкл сыворотки или плазмы крови (достаточно капли крови из пальца), длительность анализа 30 проб составляет около

40 мин, чувствительность метода равна @

0,01 мкг/мл теофиллина. 1 табл. (бычий сывороточный альбумин) .

Этот антиген позволяет получить антитела с константами связывания

9 l0 л/моль. По специфичности эти антитела близки к антителам, описанным в,Ь® известном способе.

Из антитеофиллиновых сывороток выделяют иммуноглобулиновые фракции и метят их пероксидаэой известным метоДом. Для сорбции на твердой фазе опробованы несколько коньюгированных ан1573427

40 (н N xv<((:H 1, н

О N N м

I (человеческий сывороточный альбумин).

СН;Х

О )-ннсн,сохн

I (человеческий сывороточный альбумин) тигенов теофиллина и дпя использования в методе определения теофиллина выбран коньюгат, позволяющий достичь максимальной чувствительности.

При иммунизации коньюгированным антигеном всегда образуется три типа антител: на носитель, на гаптен и на связь между гаптеном и белком. При сорбции на твердой фазе того же конью-10

Гата, который был использован дпя иммунизации, связываются все три типа антител, полного ингибирования связы" вания антител с антигеном свободным препаратом добиться не удается, из-за 15 чего чувствительностьметода Оказывается невысокой. В предлагаемом способе она равна 0,5-1 мкг/мл. Для устранения влияния антител к носителю был синтеэирова.н коньюгированный антиген, отМичдюпщйся от использованного для иммунизации белком-носителем .

О сн -м

ы о

1 снэ (человеческий сывороточный альбумин) .

При использовании такого коньюгата для сорбции на твердой фазе чувствительность метода возросла до

0,1 мкг/мл.

Следующим этапом работы был синтез коньюгатов, отличающихся от использо— 35 ванного для иммунизации не только антигенным носителем, но и типом химической связи между гаптеном и белком.

Эти коньюгаты имели следующие структуры:

СИ

О си,си,со н

О

CH) (человеческий сывороточный альбумин) .

Использование второго и третьего коньюгированных антигенов не приводит к существенному повышению чувствительности определения теофиллина, в то время как использование первого коньюгата TioBbBlIBåт чувствительность метода до 0,01 мкг/мл.

Для проведения анализа коньюгированный антиген тео-г/а-ЧСА сорбируют на твердой фазе (полистироловые 96-луночные планшеты, пробирки, шарики) в концентрациях, достаточных для насыщения твердой фазы (они подбирались экспериментально). AJIHKBOTbl по 1-10 мкл нз сывороток крови больных, получавших теофиллин, контрольных донорских ! сывороток или донорских сывороток с внесенным в них известным количеством теофиллина смешивают с разведенными антителами к теофиллину, мечеными пероксидаэой, и инкубировали 20 мин с сорбированным на твердой фазе антигеном, Количество антител, свяэавших-g с антигеном, оценивают по активности ферментной метки по сравнению с контролем. Активность пероксидазы можно измерить с помощью любого доступного субстрата, дающего после реакции с ферментом окрашенный продукт (ортофенилендиамин, 5-аминосалициловая кислота, о-дианизидин и др.).

Разведение антител подбирают предварительно таким образом, чтобы в контрольном опыте (донорские сыворотки без теофиллина) получить значения поглощения, равные 1-1,3.

Пример 1. Получение коньюгированного антигена теофиллина с бычьим сывороточным альбумином (Т"азо-БСА) . .К 20 мг 8-аминотеофиллина в 10 мкл муравьиной кислоты н 100 мкл 1 н.НС1 о добавляют 6 мг NaNO< при 0 С. Через

20 мин образовавшуюся диазониевую соль

8-аминотеофиллина по каплям добавляют к охлажденному раствору 100 мг бычьего сывороточного альбумина (БСА) в

1 мп 0,15 М фосфатного буфера, рН 8,2.

Величину рН поддерживают равной 8-9 добавлением 1 .н. NaOH. После 2-часового перемешивания при 0-10 С смесь

Специфичность антител, % к теофиллину

Вещество

3 *

0,1

0,1

0,01

0,01

0,01

0,01

0,01

Теофилли н

Кофеин

Теобромин

3-Метилксантин

Мочевая кислота

Ксантин

Гипоксантин

Гуанин

Фенобарбитал

5 15734 делят на колонке с сефадексом С-25 или диализуют против воды до тех пор, пока поглощение в диализате при

290 нм не становится меньше 0,05. Белковую фракцию лиофильно высушивают.

Содержание теофиллина в полученном коньюгированном антигенео определяют по разнице между УФ-спектрами коньюгата и БСА, исходя из Е,. =87 для т о

8-аминотеофиллина, тогда при F. z — поглощении коньюгата в концентрации

I мг/мл и поглощение исходного белка при той же концентрации, равном 0,3, и мол. м. белка и О-аминотеофиллина, равных соответственно 69000 и 200, получают замещение в молях теофиллина на моль белка:

Замещение = — — —.— —— 2О

87

200- — -1

Е,-О,З

Полученный коньюгат содержит 13 молекул теофиллина на каждую молекулу белка. 25

Пример 2. Получение коньюгированного антигена теофиллина с человеческим сывороточным альбумином (Т-r/à-ЧСА).

К раствору 40 мг 8-аминотеофиллина 30 и 90 мг человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) и 2 мл 0,0 1 H. Na0H охлажденного до 10 С, добавляют в течение 30 мин 120 мкл 25Х-ного глутароного альдегида.Реакционную смесь пере35 мешивают 1 ч и прикапывают 10 мг NaBH в 100 мкл воды. После инкубации в те-. чение 1 ч при комнатной температуре белок отделяют от ниэкомолекулярных продуктов реакции в соответствии с щ примером 1. После инкубации в течение

1 ч при комнатной температуре белок отделяют от низкомолекулярных продуктов реакции в соответствии с примером 1. Полученный коньюгат лиофильно высушивают. По данным УФ-спектров в нем с одной молекулой белка связано

15 молекул теофиллина.

Пример 3. Иммунизация животных и получение сывороток. 50

Беспородных серых кроликов иммуниэируют коньюгированным антигеном

Т-азо-БСА, 0,5 мг на,животное, коньюгат растворяют в 0,25 мп физиологического раствора и смешивают с 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда до образования устойчивой эмульсии. Смесь вво, дят подкожно в шесть мест на спине кролика. Иммунизацию повторяют через

27 6

6 недель и далее с интервалом 2-4 недели с неполным адьювантом Фрейнда.

Кровь берут через 7 дн. после иммунизации из ушной краевой вены кролика, инкубируют 30 мин в термостате при

37 С, центрифугируют при 3000 об./мин

30 мин. Полученную сыворотку хранят замороженной при -20 С. Специфичность антител к .теофиллину определяют радиоиммунологическим методом по связыванию с Н-теофиллином и твердо 3 фазным иммуноферментным методом. Специфичность антител к теофиллину, перекрестные реакции в процентах к теофиллину приведена в таблице.

Пример 4. Получение коньюгата иммуноглобулиновой фракции сыворотки с пероксидазой (18-РО).

Иммуноглобулиновую фракцию получают из антитеофиллиновой сыворотки высаливанием сульфатом аммония 50%-ного насыщения. Пероксидазу из хрена, 4 мг, растворяют в 1 мп дистиллированной воды, добавляют 0,2 мл свежеприготовленного 100 мМ NaJ04, перемешивают

20 мин при комнатной температуре, цеализуют ночь при 4 C против 1 мМ буфера а-ацетатного, рН 4,4. Добавляют

20 мкл 200 мМ карбонатного буфера, рН 9,. 6,8 мг иммуноглобулинов (растворенных в 1,0 мл 10 мГ1 карбонатного буфера, рН 9,6) и перемешивают 1 ч при комнатной температуре. Добавляют

0,1 мл свежеприготовленного NaBH (4 мг/мл воды) и инкубируют 2 ч при а

4 С. Добавляют равный объем касьпценного сульфата а п4ония, центрифугируют, растворяют осадок в воде, диализуют против О, 15 М NaC1, добавляют БСА до

2Х-ной концентрации, разбавляют в два раза глицерином и хранят при

-20 С.

1573427

Ф о р и у л а и з о б р е т е н и я

Составитель А.Скурат

Техред М.уоданич Корректор М.Иаксимишинец

Редактор Н.Яцола

Заказ 1641 Тираж 511 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

Пример 5. Приготовление стандартных растворов теофиллина для построения калибровочных кривых.

Точные навески теофиллина раство5 ряют в воде в концентрации 1 мг/л, затем соответствующие аликвоты этого раствора добавляют к пулу иэ 10 донор3

Ских сывороток так, чтобы получить стандарты, содержащие 1,5, 10,20 и

30 мкг препарата в 1 мл сыворотки.

Измерение концентрации теофиллина в сыворотках крови твердофазным иммуноферментным методом.

Пример 6. Коньюгированный ан- 15 тиген тео-r/a-ЧСА растворяют в 0,05 М

Натрийкарбонат-бикарбонатном буфере (рН 9,6) в концентрации 1 мкг/мл и сорбируют на полистироловых 96-луноче ных планшетах по 100 мкл/лунку, при

4 С. в течение ночи, затем твердую фа" зу отмывают 0,05 -ным раствором тритона Х-100 три раза и три раза водой.

Аликвоты по 1 мкл иэ сывороток крови больных, получавших теофиллин, или 25 донорских сывороток, содержащих известное количество препарата, разводят до 100 мкл буфером А: 0,0 1 M натрий-фосфатный буфер, содержащий О, 15 М

NaC1, 0,05% твин-20 и 0,2 . БСА, и сме 30 шивают с 100 мкл 1 p-PO в гом же буфере в концентрации 50 мкг/мл. Смесь тщательно встряхивают и переносят на твердую фазу с сорбированным антигеном, инкубируют 20 мин, твердую фазу отмывают и приливают раствор субстрата (4 мкл 30%-ной Н О и 4 мг ортофенилендиамина на 100 ил 0,1 М натрий-цитратного буфера, рН 5,0) детекция при 492 нм. Концентрации теофил- щ лина s расчете на разведение аликвоты до 100 мкл. Иэ полу енного значения поглощения, равного, например, О,б, можно определить концентрацию теофиллина, вводимого в реакцию с антитела- 45 ми, она равна 0,16 мкг/мл, а, соответственно, в исходной пробе 16 мкг/мл.

Пример 7. Анализ проводят как в примере б с тем отличием, что на твердой фазе сорбируют антиген теоазо-БСА, а измеряемый объем сыворотки составляет 10 мкл (разведение 1:!О).

Л р и м е р 8. Анализ проводят как в примере 7, с тем отличием, что на твердой фазе был сорбирован коньюгированный антиген тео-азо-ЧСА.

Коэффициент вариабельности метода не превышает 12 . Результаты измерения совпадают с данными, полученными методом жидкостной хроматографии высокого давления (коэффициент корреляции 0,98). Таким образом, длительность анализа сокращается на 20 мин по сравнению с известным способом при более высокой чувствительности.

Способ определения теофиллина в сыворотке крови, включающий получение антител путем иммунизации животных коньюгированныи антигенои теофиллинбелок, в котором теофиллин присоединен к белку через C?3 положение молекулы, сорбции имиунохимических реа" гентов на твердой фазе, добавления к иммобилиэованным реагентам полученных антител и исследуемой сыворотки с последующим измерением оптической плотности смеси, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и era ускорения, для иммунизации используют коньюгат, в котором теофиллин присоединен к белку азо-связью, а в качестве реагентов используют пероксидазу и коньюгат, в котором теофиллин присоединен к белку пентаиетилендиаминовой связью, причем белок в коньюгате, используемом для сорбции, отличается, по антигенности от белка, используемого для иммунизации.