Способ получения тиаминтрифосфата

 

Изобретение касается химии фосфорорганических соединений, в частности получения тиаминтрифосфата - трифосфорного эфира витамина В 1, что может найти применение в медицине. Цель - повышение выхода и стабильности целевого продукта. Синтез ведут фосфорилированием тиамина хлорида гидрохлорида смесью фосфорной кислоты и пятиокиси фосфора при 60-70°С в течение 70-90 мин. с последующей последовательной обработкой реакционной смеси на следующих ионообменных гелях: сефадекс G-10, ДЕАЕ сефадекс A-25, SP-сефадекс С-25 с выделением готовой формы целевого эфира в виде литиевой соли. Выход 5,1%, т.пл. кислой формы 194°С, литиевой соли 281°С, брутто-ф-ла кислой формы C 12H 19N 4O 10P 3S .1/2H 2O. Эти условия позволяют повысить выход целевого эфира с 0,6 до 5,1% и стабильность с 2 мес. до 2 лет. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл.

СООЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (и) А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

f10 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР! (21) 4478060/31-04 (22) 26.08.88 (46) 23,09.90. Бюл. Ф 35 (7 1) Институт биохимии АН БССР (72) И.П.Черникевич, Э.А.Гриценко, T.À.Ëó÷êî и С.В.Забродская (53) 547.26 118 (088.8) (56) Березовский В.М. и др . Нуклеотиды, коферменты, фосфорные эфиры.

Синтез кокарбоксилазы. — ЖОХ, 1963, т.33, вып.1, с. 49.

Гордон А., Форд Р,. Спутник химика. — M,: Мир,- 1976, с. 399-401.

Penttinen Н.К, Synthesis of thiamine triphosphate. Finn. chem. Lett.

1976, У 1, р.1-2. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИАМИНТРИФОСФАТА (57) Изобретение касается химии фосфорорганических соединений, в частИзобретение относится к химии фос.форорганических соединений, а именно к усовершенствованному способу получения тиаминтрифосфата (ТТФ) формулы

К С ИН

О

«р z „- .сн,сн,(ар<он>) -о, М си,— х (0" 3

1 который является .трифосфорным эфиром ,витамина В, и может найти применение в медицине .

Целвю изобретения является повышение выхода ТТФ и повышение его стабильности .

На фиг.1-3 приведены зависимости, поясняющие предлагаемый способ. (51)5 С 07. F 9/09, А 61 К 31/675

2 ности получения тиаминтрифосфата— трифосфорного эфира витамина В, что может найти применение в медицйне.

Цель — повышение выхода и стабильности целевого продукта. Синтез ведут фосфорилированием тиамина хлорида гидрохлорида смесью фосфорной кислоты и пятиокиси фосфора при 60-70 С в течение 70-90 мин с последующей последовательной обработкой реакционной смеси на следующих ионообменных гелях: сефадекс G-10, ДЕАЕ-сефадекс А-25, SP-сефадекс С-25 с выделением готовой формы целевого эфира в виде литиевой соли . Выход 5, 1%, т.пл. кислой формы

4 С литиевой соли 281 С бруттоф-ла кислой формы С Н(зН 40, $ 1 /2 Н гО.

Эти условия позволяют повйсйть выход целевого эфира от 0,6 до 5,1% и стабильность от 2 мес. до 2 лет. 1.з.п. С ф-лы. 3 ил.. 3 табл.

Фосфорилирование тиамина хлорида .гидрохлорида смесью фосфорной кислоты и фосфорного ангидрида осуществляют при 60-70оС в течение 70-90 мин, пос.ле чего ТТФ выделяют путем переосаждения из водно-ацетоновой смеси и последовательной очистки на ионообменном геле сефадекс С-10, анионообменном геле ДЕАЕ-сефадекс А-25 и катионообменном геле ЯР-сeфадeкс С-25 и готовую форму ТТФ вьщеляют в виде литиевой соли. Указанная последовательность операций, а также температурный и временной интервал процесса позволяют повысить выход ТТФ до 5,1% против 0,6% по известному способу

1594179 и резко повысить стабильность ТТФ в процессе хранения.

В отличие от известного способа, KoTopoM pJIH o I&IcTKH ТТФ используют сильнокислую ионообменную смолу, согласно предлагаемому способу для очистки последовательно используются три различные модификации сшитого полидекстрана — геля сефадекс, которые . 10 предназначены для гель-фильтрации и ионного обмена и различаются функциональными группами, привитыми к поверхности геля: сефадекс С-10 не модифицирован, ДЕАЕ-сефадекс А-25, мо- . 15 дифицированный диэтиламидной группой, и SP-сефадекс С-25, модифицированный карбоксильной или сульфогруппой

S0 1I. Снижение температуры или времени реакции соответственно ниже 60 С 20 ,и 70 мин ведет к увеличению содержания в реакционной смеси непрореагиро-: вавшего тиамина, а повышение температуры свыше 70 С и времени более

90 мин — к нарастанию содержания про- 25 дуктов термической деградации фосфорных эфиров тиамина (тиамина и тиаминмонофосфата) .

Таким образом, любое отступление от приведенных условий приводит к уменьшению выхода ТТФ и снижению его качества.

Пример 1. Ортофосфорную кислоту предварительно обезвоживают при

125 С в вакууме в течение 6 ч. Затеи

1l,25 r (0,11 моль) 98%-ной ортофосфорной кислоты и 8,75 r (0,06 моль) . фосфорного ангидрида нагревают при о

65 С до образования однородной массы и добавляют при непрерывном перемеши- 40 вании 5 г (О, 016 моль) тиаминхлорида-. гидрохлорида. Реакционную смесь выдерживают, перемешивая при данной температуре 80 мин, охлаждают до

20 С, вносят 24 г измельченного льда 45 и снова перемешивают до полного растворения (температура бани 0 С). Охлажденный раствор медленно приливают к 0,5 л безводного ацетона (0 С) и оставляют на холоду на 15 ч. Отстояв- < шийся водно-ацетоновый слой удаляют, а в остатке получают 13,6 г фосфори.лированного тиамина.

Осажденная органическим растворителем смесь еще содержит значительные остаточные концентрации свободной и солеобразующей фосфорной кислоты, гидролизующей лабильные фосфорноэфирные связи синтезированных производных. Для ее удаления из раствора осадок фосфатбв тиамина растворяют в

20 мл дистиллированной воды и пропускают через колонку (5,6x70 см) с сефадексом G-10 со скоростью 24 мл/ч на 1 сМ . Фосфорные эфиры тиамина элюируют водой с той же скоростью, собирая фракции по 10 мл. 3а качеством очистки от фосфорнокислых примесей следят с помощью высокочувствительной реакции на фосфор, а также визуально по образованию белого кристаллического осадка Ва (РО +) < при добавлении к аликвотам элюата уксуснокислого Ва. Концентрацию эфиров ,тиамина регистрируют тиохромным методом и спектрофотометрически по молярной экстинкции раствора (E .

=7400 см .M-9 при Л 272,5 нм. При гель-фильтрации на сефадексе G-10 элюируется несколько пиков. (фиг.1), из которых пик 2 фосфорной кислоты расположен на значительном удалении от пика 1 тиаминофосфатов..

Разделение фосфатов тиамина осуществляют в виде их внутренних солей бетаинового типа методом ионообменной хроматографии. Свободные от фосфорной кислоты фракции первого пика от 28 по 42 (фиг.1) объединяют, рН доводят

0,02 М трис-НС1 буфером до 7,4 и наносят на колонку (2,6x40 см) с анио-. нообменным гелем ДЕАЕ-сефадекс А-25, уравновешенную этим же буфером. Тиамин не связывается с анионообменником и вымывается в пустом объеме колонки.

После его удаления из раствора фосфаты тиамина элюируют линейным градиентом LiC1 от 0,1 до 0,4 М (по 300 мл в каждом сосуде) со скоростью 18мл/ч на 1 см . При хроматографии на ДЕАЕсефадексе получают шесть четко выраженных пиков с типичными тиаминовыми спектрами (фиг.2): пик 1 соответствует тиаминмонофосфату (ТИФ) и вымывается 0,12-0,16 M LiC1 пик 2 — тиа- н миндифосфату (ТДФ) (0,17-0,21 M LiC1), пик 3 - ТТФ (0,22-0,25 M LiC1), пикы

4 — 6 - полифосфатам тиамина (0,260,29; 0,30-0,33 и 0,34-0,36 M LiC1).

Расчет процентного содержания отдельных фосфатов в индивидуальных пиках показывает, что на долю тиаминмоно-, ди-, три- и полифосфатов приходится ,соответственно 25,0; 37,1; 28,6; 5,9; . t;8 и 0,7% всего наносимого тиамина (Т).,0,9% его оказалось в нефосфорилированной, свободной форме. Степень

159417

5 хроматографического разделения и идентификацию фосфатов оценивают методом восходящей хроматографии на бумаге FN5 в системе растворителей:

Н-пропанол — вода — 0,1 М фосфатный буфер, рН 5,0 (3:1:1) ..ТТФ находят в реакции со специфической тиаминтрифосфатазой мозга. Наличие ТДФ в составе ТТФ фиксируют ферментатив!

О но, рекомбинацией ТДФ, как кофермента, с апопируватдекарбоксилазой.

Частичное перекрывание пика ТТФ пиком синтезирующегося в более высоких концентрациях дифосфорного эфира

Т (фиг.2) приводит к незначительному, но достаточному для торможения специфической тиаминтрифосфатазной реакции загрязнению ТТФ остаточным ТДФ. Полная очистка ТТФ достигается на кати- 20 онообменном геле SP-сефадекс С-25.

Элюируемые с ДЭАЭ-сефадекса фракции пика 3 (фиг.2) объединяют, упаривают до минимального объема (1 мм;.18 С) и приливают для удаления LiC1 и трис- 25 (оксиметил)-аминометана к 10-кратному объему охлажденного до 0 С абсолютно- . го этанола. Смесь перемешивают 20 мин, а фосфорные эфиры осаждают при 0 С из 10-кратного объема безводного ацетона.. После вьщерживания в течение

30 о

15 ч при 18 С фосфаты отфильтровывают, повторно экстрагируют водой (2 мл) и перекристаллиэовывают из смеси абсолютных этанола и ацетона в соотношениях 1: 10. Выпавший осадок 35 фильтруют, растворяют в 1 мл 0,005 М натрийацетатного буфера,. рН 3,8 и наносят на колонку (1,2х60 см) с. катионообменником SP.-сефадексом С-25, уравновешенную этим же буферным раствором. Скорость тока жидкости через колонку 15 мл/ч на 1 см, объем фракции 2 мл. ТТФ не сорбируется катионообменником и вымывается в пустом объеме колонки основным пиком 1. 45 (фиг.3). ТДФ значительно запаздывает, элюируясь позже минорным пиком 3 (фиг.3). Между пиками 1 и 3 фосфатов тиамина располагается небольшой .пик 2 (фиг.3) неидентифицированной природы 50 с нетиаминовым спектром.

Очищенный препарат ТТФ не содержит примеси фосфорной кислоты и других фосфатов тиамина, однако, в водном растворе недостаточно устойчив, пос-, 55 тепенно гидролизуясь до ТДФ (на 1,62,0Х в течение 3 мес хранения при

0oÑ). Для стабилизации молекулы элюируемые с SP-сефадекса С-25 фракции

9 б пика 1 (фиг.З) упаривают на роторном

o" испарителе до 5 мл, охлаждают до 0 8 и .при интенсивном перемешивании в среде сухого азота, во избежание окисления ТТФ, приливают по каплям

20X LiOH до нейтральной реакции. Растворитель частично упаривают (1 мм;

18 С), а к небольшому объему (1 мл) литиевой соли трифосфорного эфира тиамина добавляют при перемешивании.

10-кратный объем смеси абсолютного ,этанола и ацетона (1: 10). Раствор оставляют на 15 ч при 0 С, после чего сформировавшиеся кристаллы отфильтроI вывают. Для полноты экстракции избыточного LiOH и сконцентрировавшегося при упарийании буферного раствора

CH CO0Na переосаждение ТТФ осуществляют трижцы. Выделившиеся кристаллы промывают охлажденным этанолом и су-шат в вакууме над Р O . Выход целевого продукта составляет 256 мг (5,1X) ..

Литиевую соль ТТФ хранят в среде сухого азота в ампулах по 50 мг при

0 С, Устойчивость контролируют через каждые 3 мес хранения (табл .3) .

Пример 2. Берут 11,25 r (0,11 моль) предварительно обезвожен- ной в вакууме при 125 С в течение 6 ч

987.-ной ортофосфорной кислоты и 8,75 r (0,06 моль) фосфорного ангидрида и нагревают до образования однородной массы при 60ОС, после чего добавляют при .непрерывном перемешивании- 5 r (0,06 моль) тиаминхлоридагидрохлорида. Реакционную смесь выдерживают,. помешивая при данной температуре

?О мин, охлаждают до 20 С, вносят

24 г измельченного льда и снова перемешивают до полного растворения (температура бани 0 С) . Дальнейшие операции получения ТТФ (осаждение органическим растворителем образовавшейся за время фосфорилирования смеси фосфорных эфиров тиамина, разделение фосфатов тиамина методами ионообменной хроматографии на анионо- и катйонообменных смолах и перевод полученного раствора тиаминтрифосфорной кис" лоты в литиевую соль, в среде сухого азота) проводят способом, идентичным способу, описанному в примере 1. Выход целевого продукта составляет

216 мг (5X) .

Влияние температуры на скорость фосфорилирования тиамина за 70 мин протекания реакции показано в табл.i. зависимость скорости синтеза фосфор1594179 ных эфиров тнамина от продолжительности реакции при 60 С - в табл.2.

Пример 3. Берут 11,25 г (0,11 моль) предварительно обезвожен ной в вакууме в течение 6 ч при

125 C 98 -ной ортофосфорной кислоты и 8,75 r (0,06 моль) фосфорного ан гидрида и нагревают до образования однородной массы при 70 С, после чего 10 добавляют при непрерывном перемешивании 5 r (0,016 моль) тиаминхлоридагидрохлорида. Реакционную смесь выдерживают, помешивая при данной тем-, пературе 90 мин,. охлаждают до 20 С, .вносят 24 г измельченного льда и снова перемешивают до полного растворе-. ния (температура бани 0 С) . Все последующие операции получения ТТФ, а именно осаждение органическим раство- 20 рителем образовавшейся за время фосФорилирования смеси фосфорных эфиров тиамина, разделение фосфатов тиамина методами ионообменной хроматографии на анионо- и катионообменных смолах и перевод, полученного раствора ти- ." аминтрифосфорной кислоты в литиевую соль в среде сухого азота, проводят способом, идентичным способу, описанному в примере 1. Выход целевого 30 продукта составляет 250 мг (5,1 }. .Влияние температуры на скорость фосфорилирования тиамина за 90 мин протекания реакции показано в табл.1, зависимость скорости синтеза фосфорных эфиров тиамина от продолжительности реакции при 70"C - в табл.2.

Полученный препарат литиевой соли

ТТФ хроматографически однороден и s используемой системе бумажного хро- 40 .матографирования его подвижность (К ) составляет 0,22, не отличаясь от таковой для кислой формы ТТФ, вы"i деленного Фракционировйнпем фосфатов . на SP-сефадексе С-25 (фиг.3) . При 45 рекомбинации ТТФ с апопируватдекарбоксилазой дрожжей не наблюдалось образования холоформы Фермента, под

4 тверждая тем самым отсутствие в синтезируемом препарате примесных концентраций ТДФ. Температура плавления кристаллов кислой формы ТТФ равна

194 С, солевой (в виде литиевой соли) 281 С. Элементный анализ для кислой Формы трифосфорного эфира тиамина.

Найдено, : С 27,49 + 0,3.1;

Н 3,98 +0,09:, N 10,67 «+ 0,19;

P 18,14 + 0,16; Н О 2,01 + 0,07..

С VÄN 0 P>S 1/2 Н О.

Вйчйслено, : С 28,08,. Н 3,93;

N 10,92; P 18,10, Н О 1,56.

Соотношение числа атомов Li литиевой соли к числу молей ТТФ соответствует 2.

Таким образом, предлагаемый спо.соб синтеза ТТФ позволяет значительно (от 0,6 до 5,1 ) повысить выход ТТФ по сравнению с известным способом и, кроме этого, значительно (от 2 мес до ! до 2 лет) повысить устойчивость препарата.

Формула изобретения

1. Способ получения тиаминтрифосфата взаимодействием тиамина хлорида гидрохлорида с фосфорной кислотой и фосфорным ангидридом при нагревании с последующим выделением целевого пропродукта.,переосаждением иэ водноацетоновой смеси и хроматографической очисткой, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, нагревание ведут до 60-70 С в течение 70-90 мин и хроматографическую очистку осуществляют последовательно на фильтрующем геле сефадекс С-.10, на анионообменном геле

ДКАЕ"сефадекс А-25 и катионообменном геле SP-сефадекс С-25.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й-с я тем, что, с целью повышения стабильности тиаминтрифосфата, его выделение осуществляют в виде литиевой . соли.

1594 79

Та блица

Влияние температуры на скорость фосфорилирования тиамина эа 70 (а), 80 (б) и 90 мин (в) протекания реакции

Относительное содержание, 7., фосфорных эфиров тиамина в продукте реакции фосфорилирования

Температура реакции, С

Т ТМФ ТДФ ТТФ Полифосфаты б) 30

17,0

4,4

60 1,6

0,9

0,8

0,8

1,3

120

4,8

Таблица 2

Зависимость скорости сиитеэа фосфорных эфиров тиамина от продолжительности реакции при температурах 60(a), 65 (б) и 70 С (в) Относительное содеркание, Х, фосфорных эфиров тиамина в продукте реакции фосфорилирования

Время реакции

Т ТИФ ТДФ . ТТФ Полифосфаты б) ЗО

70

3,7

5,6

6,7

8,4

t1 3 388, 327

3 18 32 3 34э2

1,5 28,4 36,4

0,9 25 0 37,1 а) 30

120 в) 30

5.0

120 а) 30

100 !

150

19,6

5,3.

2,7

1,5

1,3

1,2

1,0

2,3

13,9

3,8

1,0

1,!

f 1

1,3, 2,4

8,9

14,0- 43,2

5,3 36,6

2,7 32,4

1,6 29,0

:1,0 27,3 1,1 26,9

1,9 30,0

2э7 34 ° 9

52,2

46,7

32,4

28,4

26,4

24,2

23,9

35,1

51,4

42,2

29,0

25,0

2f,0

19,7

25,6

37,6

48,2

37,2

27,3

23,5

22,9

23,0

2.7, 7

41,0

29,1

32,6

35,0

° 36 4

37,6

37,9

36,7

34 5

2t i3

29,5

35,0.

36,4

37,2

38,7

40,1

36,3

24,4 .

32,2

36,4

37,1

41,!

42,4

40,2

34,6

29,0

34,4

37,6

38,3

39,6

40,0

38,7

31,6

6,7

14,8

23,9

27,0

27,9

28,0

26,9

19,7

7,0

16,3 . 25,8

28,6

28,4

27,9

24,!

15,7

8,4

18,6

26,4

28,8

28,0

26,7

23,3

13,1

10,8

20, 7

23,9

25,8

26,4

26,!

24,0

21,6

13 5

24,1

27,0

28,6

0,2

3,7

6,0

6,7

7,2

7,9

8,1

6,6

0,2

4,9

7,2

8,4

8,7

9,2

8,8

7,3

0,5

6,0

7,7

8,3

8,4

9,0

7,9

5,4

2,9

4,8

6,0

7,2

7,.7

8,0

7,4

6,3

1594179

Продолжение табл.2 .

Время реакции

Относительное содержание, %, фосфорных эфиров тиамина в продукте реакции фосфорилирования

Т ТИФ ТДФ ТТФ Полифосфаты

90 1,1

100 1,9

120 . 3,4

150 5,1

28,8

27,9

23,3

18,4

38,3

38,1

37,2

33,7

8,3

7,2

6,6

5,8

23,5

24,9

29,5

37,0

Таблица 3

Зависимость степени гидролиза тиаминтрифосфата от времени и формы хранения препарата

Степень гидролиза, %, через, мес.

6 9 12 18

Исследуемая форма тиаминтрифосфата з 24

0,10

0 12 :Оэ37 . Оэ69

0,17 . 0;31 0,78

1,04 2,42 6, 19

Литиевая соль

Кислая форма

0,5%-ный водный раствор

1,86 3,63 14,71 36,98

Степень гидролиза тиаминтрифосфата определяют ферментативным методом, по количеству образовавшегося ТДФ, а также хроматографически в системе растворителей н-пропиловый спирт — вода — 0,1И фосфатный буфер, рН 5,0, 3:1:1. Структурную целостность и идентичность хранящегося препарата оценивают по реакции со специфической тиаминтрифосфатазой мозга (Кф 3.6.1.28) .

s) 30 60

80

100

120

150

10,9

3,0

11 3

0,8 1,1 .2,3

4,8

7,4

38,1

31,3

26,4

21,0

22,9

25,2

31,3

39,6

33,3

35,1

37,2

41,1

39,6

38,7

36,0

32,6

13,7

24,7

27,9

28,4

28,0

26,8

21,6

15,5

4,0

5,9

7,2

8,7

8,4

7,0

6,3

4„9

I594I79 г!па

720 г,у

02

7бО

5 72П ею фр

«50 с

Е

° И ФГ +б Я7 5Ф 8 EZ номера урании

Фиг.1

10 20 Я . 28 32 М . Ромера фракции

Фиг.2

1594 t 79

М и с я

Е 25

81g Q Я . 76 номера фракции

Составитель Л.Карунина

Редактор Н.Рогулич Техред M.Ходанич

Корректор Л. Бескид

Заказ 2812 Тираж 316 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101