Способ получения цианидгидратазы
Изобретение относится к биотехнологии. Цель изобретения - повышение активности целевого продукта. Способ получения фермента цианидгидратазы включает непрерывную культивацию штамма микроорганизма при определенных температурах, PH и скорости разбавления, а также непрерывном введении в культуру цианид-ионов и/или цианистоводородной кислоты в концентрации не менее 15 мм. Фермент стабилен в течение до 130 дней. Предпочтительным микроорганизмом является штамм FUSARIUM LATERITIUM NEES CMI 300533, депонированный в соответствии с Будапештским соглашением в Микологическом институте здравоохранения, KEW, RICHMOND, SURREY, Великобритания. 6 з.п.ф-лы. 2 табл, 1 ил.
COK)3 СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН (51)5 С 12 М 9/02
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н llATEHTY
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
t (21) 4202067/30-13 (22) 18. 02. 87 (31 ) 8604068 (32) 19.02.86 (33) ГВ (46) 23.10.90. Бюл. ¹ 39 (71)Империал Кемикал Индастриз НЛС (СВ) (72) Кеннет Раймонд Ричардсон и Питер Морис Кларк (ГВ) (53) 577.15 (088.8) (56) FP № 0061249, кл. С 02 Г 1/58, опублик. 198?. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИАНИДГИДРАТА 3Ы (57) Изобретение относится к биотехнологии. Цель изобретения — повышение
Изобретение относится к биотехнологии и касается получения цианидгидратазы № 4.2.1.66 (известный также под названием формамидгидролиа— за).
Цель изобретения — повышение активности целевого продукта.
Способ заключается в подборе условий ферментации продуцирующего фермент микроорганизма и добавлении в процессе культивирования к культ уре цианид-ионов и/или цианистого водорода, что обеспечивает превращение нх в цианистоводородную кислоту, и предусматривает использование таких бактериальных микробрганизмов ц грибков, как
Stemphylum loti ATCC 11718, Mycoleptodiscus terrestris CBS 231 53, Fusarium moni.fnrme СВБ 16182, Нс1—
minthospor зогрЬт.со1а CF. .. 249.40, „„SU„„1602394 А 3
2 активности целевого продукта. Способ получения цианидгидратазы включает непрерывную культивацию штамма микроорганизма при определенных температурах, рН и скорости разбавления, а также непрерывном введении в к1пьтуру цианид-ионов и/или цианистоводородной кислоты в концентрации не менее 15 ммоль. Фермент стабилен в течение до 130 дней. Предпочтительным микроорганизмом является штамм Fusarium lateritium Nees
СМ1 300533, депонированный в соответствии с Будапештским соглашением в Микологическом институте здравоо хранения, Kew, Richmond, Surrey, Великобритания. 6 з.п. ф-лы, 1 ил.
2 табл.
Peniconia circinata CBS 263 37, Glomerella tucamanensis CBS 132,37. "
М 4
Предпочтительным штаммом является Гттзаг1тттл latiritium ees
СМ1 3005333, непатогенный по отношению к пшенице и обладающий следующими характеристиками.
Ж
Морфологические характеристики, 4-в
Среда (1) Potato Sucrose Agar (PSA).
250 r промытого и нарезанного картофеля помещают в котел и выдерживают в нем при давлении.15 фунтов на
1 кв. дюйм в течение 15 мин. Отвар процеживают через два слоя муслина, (Jhl добавляют к мутному фильтрату 2r". глюкозы и 2Х агара, выдерживают среду в автоклаве и диспергируют. (2) Czapek-Вох (моди,зиттированный) агар (ОхоЫ) (СЛА) .
1602394
"Oxoid" — зарегистрированный товарнь>й знак. о
Условия культивации: 25 С, несколько недель.
Скорость роста: 4,0 см за 3 дня, 3,0 см за 3 дня соответственно.
Характеристика роста: хлопьевидноопушенно разрастающиеся колонии с белым воздушным мицелием. Субстрат на PSA серовато-розовый с пятнами малинового цвета, переходящего в желтый, несколько более бледный íà CDA.
Иногда образуется пигмент темно-красного цвета, в частности при старении, Через одну-две недели воздушный мицелий приобретает коричневую окраску и разрушается. Колония при этом становится довольно слизистой, образуются спосодохии,, от розового до коричневого цвета на PSA и оранжево-розового на CDA.
Выделение жидкости не происходит, Цвет образующегося пигмента обычно такой же, как и мицелия. 25
Конидии. Иикроконидии в случае этого организма не образуются. Иикроконидии образуются из однолатеральных фиалид или мультиразветвленнык конидиофор с короткими фиалида- 0 ми. В более старых культурах конидиофоры аггрегируют с образованием спо-родохий, в частности, íà CDA. Форма конидий может изменяться от серповидной до. искривленной fusoid спиннобрюшной, с количеством перегородок
3-5, обычно 5 в более молодых, культурах. Размер спор находится в пределах (25-30)х(2,5-4,0) мкм.
Опорная клетка часто имеет ножку
40 в частности в случае спор с более чем 5 перегородками., В мицелии попадаются набухшие клетки,.иногда встречаются хламидоспоры, интеркалярные, одиночные или звеньями.
Грибки могут расти в двух различных формах, шарообразной или гранулообразной, а также в дисперсной форме, когда они представляют собой диффузные волокнистые пряди,диспергированные в питательной среде. При
50 использовании для обработки материалов важно, чтобы грибки росли в дисперсной, а не в шарообразной или гранулообразной форме. Поскольку рост
55 в гранулообразной форме тормозится за счет диффузии питательных веществ и газов через гранулы, процесс культивации в этом случае является неэффективным. Условия культивации предлагаемого способа должны быть благоприятными для роста грибков в дисперсионной форме.
Грибковый штамм может быть выращен в условиях кислородного или углеродного контроля. Предпочтительными являются условия, когда эффективный рост осуществляется при одновременном кислородном и углеродном контроле. B качестве питательной среды используют среду определенного состава, а именно содержащую помимо источника углерода минеральные соли без добавок каких-либо неопределенных органических материалов, таких как дрожжевой экстракт.
В качестве источника углерода для осуществления предлагаемого способа можно использовать любой подходящий источник. Предпочтительно использовать для этой цели глюкозу. Источником азота являются сульфат и гидроокись аммония, а источником фосфора — . фосфат калия и фосфорная кислота.
Основные компоненты питательной среды используемой при осуществлении предлагаемого способа, содержатся в ней в следующих количествах, r:
НзРО4 10-20 мМ
К 804 800-1400
MPSO4 7Н О 700-1200
Глюкоза Н О 10000-40000 (NH4) SO4 500 3000
Иикроэлементы О, 1-20
Оптимальная питательная среда, вводимая в культуру в стационарных условиях, имеет следующий состав, г/л:
1 М Н,РО4 320 мп/20 л
Микроэлементы и биотин 10 мл/20 л
К,804 20/20
MgS04 7Н О 18/20
Глюкоза Н О 223/20 (NH ),SO, 50/20
Состав раствора микроэлементов и биотина. (в растворе на 1 л), r:
FeC 1> 6Н О 9,6
Си ЯО 4 5Н О 3,6
MSO 4Н О 30,0
ЕпЯО 7Н О 38,0
Биотин, r 0 52
Цианид-.ионы или цианистоводородная кислота вводятся в культуру отдельно или вместе с другими питательными веществами на стадии культивации
5 16 предлагаемого с пас об я . Пр едпочтител ьно цианиди. добавляют к питательной среде, вводимой н культуру, в виде цианидов щелочного металла, например цианида калия или натрия. В начале стадии культивации цианиды добавляют в небольпптх количествах, ко торие затем, по мере гриспособления к ним клеток грибка в культуре, постепенно увеличивают и в уже установившихся стационарных условиях вводят в концентрации как минимум
15 ммоль в расчете на общее количество п. 4-6 ммоль/г сухих клеток. Обнаружено, что с ростом концентрации цианид-ионов в питательной среде, вводимой н культуру в стационарных условиях, увеличивается активность фермента цианидгидрятязи, причем величина его активности ливейно зависит от концентрации пианид-ионов. Так, например, активность фермянта, вираженняя в микромолях образующегося н 1 мин на 1 л культур.t формамида, при неболыпом содержании (20 ммоль) ранна ??О. Предпочтительными являются следующие условия культивации предлагаемого способа: скорость разведения 0,05-0,1 ч, pH 5,0-6,0 предпочтио тельно 5,5; темперятура 28-3? С, предпочтительно 30-3? С. В этих чславиях активность получаемого фермянтя максимальна. В процессе кчльтивяции. кчльтуря непрерывно отводится из ферме нт ят ара, в котором rrpovo!grTca культиняция. Клетки, содержащие фермент цияНИДГИДРЯтЯЗч, ОтЛЕЛЯЮт AT ВИВаДИМОй из ферментятора культури любим подходягrrrM rпособам, предпочтительно путем фильтряции. Отделенние клетки могут бьггь висушени и падвергнути затем дальнейшей обрябатке, например экструзии, для па:тччения со— держащего лиани;,гилрятязу кчеточнor о мятерияля в любой нужной форме, ня— пример, в виде ягрегятов или порошка. Фермент может бить тякже отделен оТ клеток и ис лап ьзоняться в ниcToM виде. Обична в этом вет необходимости, поэтому, кяк прявила, ферме нт Hp отделяют оТ клеток. 02394 Содержя1ций цианидгидратазу материал, полученный по предлагаемому способу, может использоваться для обработки цианидсодержащих сточных вод. Полученный предлагаемым способом фермент обладает высокой стабильностью (период полураспада его, например, может составлять до 130 дней) и высокой активностью, Высокостабильный ферментосодержащий материал может быть получен, если стадию культивации предлагаемого способа проводить в условиях кислородного или одновременно кислородного и углеродного контроля. Фермент, содержащий материал с высокой активностью, может бьггь получен при проведении стадии культивации предлагаемого способа при 30-3?о С. Пример 1. Пианидгидратазу получают путем культивации штамма Гизягштп Сг11 300533 в присутствии HCN непрерывным способом, вводя в культуру питательную среду указанного состава на глюкозе. Культивацию проводят н стационарных условиях при различных температурах, рН 5,5 и скорости разбавления 0,10 ч . Полученние результаты снедены в табл. 1, из которой видно, что максимальная активность фермента достигается при температуре культинации 30-32 С, а о при более низких температурах получаемая активность вдвое меньше максимальной. При температуре вьппе 34 С о роста культуры не происходит. Активность фермента выражена в микромолях формамида, получаемого в минуту из 100 ммаль цианида натрия при рН 8,5. Л р и м е р 2. Цианицгидратазу получают путем культивации штамма Гпзягium latiritium Сг|1 300533 в присутствии HCN непрерывным способом, вводя н культуру питательную среду указанного состава на глюкозе. Культивацию проводят н стационарных условиях при различной скорости окисления и постоянных рН (5,5), температуре (30 С) и скорости разбавления (О, t0 ч ). Образующийся фермент подвергают сублимационной сушке и о хранят при 4 С над силикагелем. Стабильность полученного фермента кантролируют путем анализа аликвотных проб через определенные промежутки времени. Полученные результаты сведены в табл. 2, из которой видна, что ста1602394 40 бильность фермента при хранении возрастает, если культивация проводится при одновременном кислородном и yi леродном контроле, Пример 3, Индукционный профиль цианидгидратазы определяют путем культивации штамма Гisarium СИ1 300533 непрерывным способом, вводя в культуру питательную среду . 10 указанного состава на глюкозе. Культивацию проводят в стационарных условиях при различных концентрациях HCN, поддерживая постоянными рН (5, 5), температуру (30 С) и c корость разбавления (0,10 ч ) . На чертеже приведен график линейной зависимости между индукцированной активностью и концентрацией цианида. 20 Линейность сохраняется до концентрации цианида в питательной среде как минимум 24 ммоль.. На графике пс оси ординат отложен номинальная концентрация цианида, а по оси абсцисс 25 общая активность. Пример 4.1 1тамм Fusarium СМ1 300533 вырашивают непрерывным способом в емкости объемом 6000 л с испопьзованием питательной среды указанного состава, 30 содержащей в качестве источника углерода глюкозу. Скорость роста контролируют концентрацией глюкозы. рН поддерживают в пределах 5,0 и 5,8, скорость разбавления составляет 0,080,1 ч, температура 30-32 С. Пианид натрия добавляют к питательной среде в количестве 61,5-73,5 ммоль. Культивацию проводят в условиях кислородного голодания, для чего уменьшают интенсивность аэрирования. В результате происходит образование этанола в количестве 0,81 г/л. За 140 ч получено 12,2-14,3 г/л биомассы с активностью цианидгидратазы 81,0 — 45 122,4 ед, т.е. 81,0-122.,4 мкИоль формамида в 1 мин на 1 мг сухого веса (для анализа брали 120 ммоль раствора цианида при рН и температуре 200С). Фор мула из обретения 1. Способ получения циаяидгидратазы, предусматривающий непрерывное культивирование в условиях аэрации продуцирующего фермент микроорганизма в водной питательной среде, содержащей источник углерода, приемлемый для данного микроорганизма, неорганические питательные вещества и раствор микроэлементов, при непрерывной подаче источника цианид-ионов и/или цианистого водорода с последующим выделением клеток, содержащий цианидгидратазу, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, культивирование ведут при 28-3? С, рН 4,5-7,5 и скорости разбавления среды в интервале 0,05-0,11 ч, а. минимальную концентрацию цианид-ионов и/или цианистого водорода, вводят в питательную среду, устанавливают не менее 15 ммоль. 2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что продуцирующим фермент микроорганизмом является штамм Fusarium latiritium Nees CMI 300 533. 3, Способ по п. 1, отличаюшийся тем, что источник цианидионов и/или.цианистого водорода добавляют к культуре в количестве, эквивалентном 2-10 ммоль/г сухих клеток. 4, Способ по п. 1, о т л и ч а юш и и с я тем, что источник цианидионов и/или цианистого водорода добавляют в концентрации 4-6 ммоль/г сухих клеток, 5. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве источника углерода используют глюкозу. б. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что культивирование ведут при рН предпочтительно 5,0-6,0. 7. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что культивирование осуществляют предпочтительно при 30-32 С. 1602394 10 таблица 1 Температ ура, С, ммоль С рН Удельная активность, Гкорость разбавлеед./мг сухого веса ния, ч Т а б л и ц а 2 г Период полураспада, дн. Оксигенация Аэробные условия Средняя аноксия Жесткая аноксия 21 63 20 12 40 Составитель И.Привалова Редактор С,Патрушева Техред Л.Сердюкова Корректор Л.Бескид Заказ 3280 Тираж 479 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 59,3 27,5 27,1 22,7 54,2 52,3 0,05 0 05 0 05 0,05 0 05 0,05 0 05 30,0 28,0 27,0 25,0 25,0 30,0 32,0 15,4 14,4 15,2 13,2 14,7 14,0 14,8
