Способ определения оксидазы бактерий

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для дифференциации аэробных бактерий. С целью ускорения реакции и повышения точности оксидазного теста в качестве реагента на оксидазу используют 0,5- 1,0%-ный водный раствор этилоксизтилпарафенилендиамина сульфата, которым пропитывают полоски хроматографической бумаги, а исследуемые бактерии обрабатывают суббактериостатическими дозами этилендиаминоуксусной кислоты (ЭДТА-Na), добавляемой к питательной среде, подходящей для роста бактерий. Препарат ЭДТА вводят в состав среды в количестве 0,01-0,04%, а штаммы выращивают в течение 24-48 ч до достижения ранней стационарной фазы. Преимущество предложенного способа за .слючается в ускорении реакции и выявлении слабореагирующих штаммов, которые не определялись известными оксидазными тестами. 2 табл. с iS (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

9 А1 (19) (11) (59 4 С 12 Б 9/02, 9/00 (С 12 N 9/02 //С 12 R 1:01) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ Й ОТКРЫТИЙ г (21) 4103078/28-13 (22) 25.07.86 (46) 15.05.88. Бюл. В 18 (71) Белорусский государственный институт усовершенствования врачей (72) А. А. Кукулянский и А. Д. Соколовская (53) 577.15(088 ° 8) (56) Kovacs N. Identification of Pseudomonas yyocysues by the охЫазе

reaction. Nature London, 1956, :v. 178, р. 703.

Никитин В. М. Справочник методов биохимической экспресс-индикации микробов. Кишинев, 1986, с. 5-8. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКСИДАЗЫ БАКТЕРИЙ (57) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для дифференциации аэробных бактерий.

С целью ускорения реакции и повышения точности оксидазного теста в качестве реагента на оксидазу используют 0,51,0Х-ный водный раствор этилоксиэтилпарафенилендиамина сульфата, которым пропитывают полоски хроматографической бумаги, а исследуемые бактерии обрабатывают суббактериостатическими дозами этилендиаминоуксусной кислоты (ЭДТА-Na) добавляемой к питательной среде, подходящей для роста бактерий.

Препарат ЭДТА вводят в состав среды в количестве 0,01-0,047, а штаммы выращивают в течение 24-48 ч до достижения ранней стационарной фазы.

Преимущество предложенного способа заключается в ускорении реакции и выявлении слабореагирующих штаммов, которые не определялись известными оксидазными тестами. 2 табл.

1395669 по методу Ковача (известный) 25 (66 штаммов ) при использовании реагента (ЭОЭФДсульфата) без предварительной обработки бактерий ЭДТА-Na

33 (87Е штаммов) при использовании того же реагента с предварительной обработкой бактерий ЭДТА-Na 38 (1OOX штаммов) Изобретение относится к микробиологии и,может быть использовано для дифференциации аэробных бактерий.

Цель изобретения — ускорение ре5 акции и повышение точности оксидазного теста.

В качестве реагента на оксидазу используется этилоксиэтилпарафенилендиамин (ЭОЭФД) сульфат, а исследуемые 10 бактерии предварительно обрабатываются суббактериостатическими дозами натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА-Na), добавляемой к среде, на которой выращивают бакте- 1; рии. Препарат ЭДТА-Na вводят в состав ! питательной среды„ на поверхности которой исследуемые штаммы выращивают в в течение 24-48 ч (в зависимости от ( скорости роста и до достижения ранней стационарной фазы). Концентрацию.

ЭДТА-Иа в среде варьируют в диапазоне

0,01-0,04 . При более высоких концентрациях препарата наблюдается бактерностатическое действие. Оптимальная концентрация для большинства иссле дуемых штаммов равна 0,03 . Значение предварительной обработки бактерий

ЭДТА-.Яа объясняется повышением проницаемости клеточной мембраны и вследствие этого ускорением контакта между

Число быстро реагирующих штаммов (15 с) в этих случаях равно соответственно 11 (29 ) штаммов; 15 (39,4X) штаммов; 36 (94,7X) штаммов.

Пример 2. Исследуют эффект используемых концентраций ЭОЭФД-сульфата и ЭДТА-Ба на результаты определения оксидазы. С этой целью 38 штаммов

7 видов оксидазопозитивных бактерий (перечисленных в табл. 1) выращивают на питательном arape c добавлением разных концентраций ЭДТА-Na (0,005 "

0,06X). Полоски хроматографической. бумаги смачивают 0 25 0 5; 1,0„ 2,0 и 4,0 растворами ЭОЭФД-сульфата. Биомассу исследуемых бактерий наносят на увлажненную бумагу платиновой петлей. Результаты приведены в табл. 2., бксидазой и фенилендиаминовым реагентом.

Пример 1. Исследуют суточные культуры 7 видов оксидазопозитивных бактерий (38 штаммов) и 5 видов оксидазонегативных бактерий (12 штам" мов) после подращивания на питательном агаре с 0,03Е ЭДТА-Na. Оксидазную активность определяют следующим образом. Полоски хроматографической бумаги (Schuell 1аиГепс1) смачивают

0,5Å-ным водньм раствором сульфата этилоксиэтилпарафенилендиамина и помещают на дно чашки Петри; микробную массу снимают платиновой петлей с поверхности среды и наносят штрихами на увлажненные полоски бумаги. Быстрая реакция — коричнево-красное окрашивание бумаги в течение 1-15 с. Медленная реакция — такое >ке окрашивание бумаги в пределах 16-60 с. Отрицательная реакция — отсутствие какоголибо окрашивания. Окрашивание бумаги за время более 1 мин оценивают как сомнительную реакцию.

Результаты сравнительных опытов приведены в табл. 1„

Как видно из табл, 1, из 38 штаммов оксидазопозитивных бактерий положительную реакцию дали:

В табл. 2 приведены результаты определения оптимальных концентраций

ЭОЭФД сульфата и ЭДТА-Na: число штаммов, положительных по оксидазному тесту (число быстро реагирукицих штавгмов).

Данные табл. 2 свидетельствуют, что оптимум концентрации ЭОЭФЦ-сульфата в растворе находится в пределах

0,5-2,0Е (в/о). При более низких концентрациях (40,25%) реакция с оксидазопозитивными штаммами выражена слабо и оценивается как сомнительная, При выходе за верхнюю границу указанного оптимума (ь 4,0 .) наблюдают фоновое коричневое окрашивание бумаги, интенсивность которого пропорциональна концентрации pearента. Наличие

1395669

4 нилендиамина и тетраметилпарафенилендиамина.

Преимущество предложенного способа заключается в ускорении реакции

5 и выявлении слабореагирующих штаммов, что приводит к повышению скорости и точности оксидазного теста. такого фонового окрашивания затрудня ет достоверность учета реакции на оксидазу.

Оптимальная концентрация ЭДТА-Na в питательной среде установлена в пределах 0,1-0,47 (в/о), причем наибольшее число быстрых реакций на оксидазу получается при обработке штаммов 0,03-0,047 ЭДТА-Na. Концент- 10 Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я рация 0,047. является пороговой, близкой к бактериостатическим концентрациям. Поэтому в качестве рабочей концентрации предпочтительнее использовать 0,037 ЭДТА-Na. 15

Ф

Пример 3. Штаммы оксидазоположительных и оксидазоотрица тельных бактерий засевали на подходящую.для каждого вида питательную среду или 20 не содержащую ЭДТА Na. Через 18 ч после инкубации при 37 С с помощью секундомера определяли наличие и скорость оксидазной реакции по предлагаемой методике с использованием ЭОЭФД, а 25 также следующих аналогов: диметилпарафенилендиамина, диметилпарафенилендиамина сЫ -нафтолом, диэтиппарафеЧисло штаммов с быстрой или медленной положительной реакцией

Вид бактерий"

Количество штаммов

Предлагаемый метод"" без ЭДТА-Na с ЭДТА-Na

Прототи всего до 15 с 16—

60 с до 16-60 с до 16-60 с

15 с 15 с

10

27 О

2 0

4 0

2 0

0 1

В. bronchiseptica

F. meningosepti curn

0 0 0

11 14 15 18

Всего:

36 2

Оксцдаэопоэитивные:

P. aeruginosa

P. ma1bophilia

P. cepacia

P. Г1иогезсепз

М. osloensis

Способ определения оксидазы бактерий > предусматривающий культивирование исследуемой культуры на твердой питательной среде, оценку активности с использованием в качестве реагента парафенилендиаминового соединения, о т л и ч:а ю шийся тем, что, с целью ускорения реакции и повышения точности оксидазного теста, исследуемые культуры выращивают на твердой питательной среде в присутствии натриевой соли этилендиаминуксусной кислоты в количестве от 0,01 до

0,04 мас.% до достижения стационарной фазы роста, à в качестве реаген,та используют водный раствор этипок= сиэтилпарафенилендиамин сульфата.

Таблица 1

11 11 16

1 2 0

1 1 О

1 1 1

О 0 0

0 0 0

1395669 Продолжение табл.1

Вид бактерий"

Число штаммов с быстрой или медленной положительной реакцией

Количе.ство штаммов всего

Прототип Предлагаемый метод" + до 15с 1660 с без ЭДТА-Na с ЭДТА-11а до 16-60 с до 16-60 с

15 с 15 с

Ок сида з он ег ативные:

0 О О

А. са1соасеЫcus

О О О

0 . О 0

О О 0

О О

О О О

О О

0 О

О О О

Всего:

25 штаммов P. aeruginosa, 3 штамма P. cepacia., 5 штаммов P. vulgaris, 2 штамма К. pneumoniae и 2 штамма Е. coli выделены из клинических материалов, остальные штаммы получены из ГИСКа им. Тарасевича;

Концентрации реактивов: ЭДТА-Na 0,03%; ЭОЭФД сульфат 1,0Ж.

Таблица 2

ЭДТА-Иа, 7

0,01-0,02

ЭОЭФД-сульфат, Е

О, 03-0, 04 О, 05" О, 06

0-0,005

Положительная реакция проявляется в слабом окрашивании бумаги; оценивают как сомнительную

« 0,25

38(36) 5(2) 33(15) 37(30) 0,5-2,0

-4,0

Учет реакции затруднен из-за фонового коричневого окрашивания бумаги под действием ЭОЭФД-сульфата

Составитель В. Соина

Редактор Т. Лазоренко Техред И.Верес Корректор Л. Пилипенко

Заказ 2466/26 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

P. vulgari s

К. pneumoniae

С. f reundi i

Е. coli

О О

О О

О О