Способ получения люциферазы светляков

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к способу получения люциферазы светляков. Цель изобретения - увеличение активности и стабильности люциферазы и повышение ее концентрации в растворе. Лампочки светляков растирают с карборундом , инкубируют в буферном растворе , содержащем 0,3-0,8 М минеральной соли, 15-25% глицерина или 0,2- 0,4 М сахарозы в качестве стабилизирующих добавок, при этом массовое соотношение лампо11ки светляков:буферный раствор составляет 1:(8-30). Осадок отделяют, а надосадочный раствор подвергают дифференциальному ультрацентрифугированию сначала 15-45 мин при 15-30 тыс. g, затем 1-2 ч при 140 тыс. g. Активность полученного раствора 1,0-10 мВ/мл, удельная активность 13 -10 мВ/мг белка. При хранении при 4°С в растворе в течение месяца препарат сохраняет 50% активности . 4 з.п. ф-лы. с (Л со со ( 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (51) 4 С 12 N 9/02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4017238/31 — 13 (22) 23.01. 86 (46) 23.09. 87. Бюл. У 35 (71) МГУ им, М. В. Ломоносова (72) Н, Ю. Филиппова, А. Ф. Духович, Н. Н. Угарова и В. А. Букатина (53) 663. 18(088. 8) (56) Branchini В. R,, Marschner Т, М,, Montomurro А, М, А convenient affinity chromatography basend on purifi—

cation of fireffy luciferase Analytiса1 Biochenuctry. — 1980, v, 104, р. 386-396.

Вепу В, М,, Dolwo М, Fractionation of fireffy luciferase on anion

changers. — РЕВЯ Letters 1976, V. 70, У I р. 167-1 70.

Филиппова Н, Ю,, Духович А. Ф., Букатина В. А., Угарова Н, Н, Аллостерический механизм регуляции активности люциферазы из светляков Luciola mingrelica. — Биохимия, 1984, т. 4, с, 1965-1972, „„SU„„1339128 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЮЦИФЕРАЗЫ

СВЕТЛЯКОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения люциферазы светляков. Цель изобретения — увеличение активности и стабильности люциферазы и повышение ее концентрации в растворе. Лампочки светляков растирают с карборундом, инкубируют в буферном растворе> содержащем 0,3-0,8 M минеральной соли, 15-257 глицерина или 0,20,4 M сахароэы в качестве стабилизирующих добавок, при этом массовое соотношение лампочки светляков:буферный раствор составляет 1:(8-30). Осадок отделяют, а надосадочный раствор подвергают дифференциальному ультрацентрифугированию сначала 15-45 мин при 15-30 тыс. g затем 1-2 ч при

140 тыс. g. Активность полученного раствора 1,0 .1О Э мВ/мл, удельная активность 13 .10 мВ/мг белка. При хранении при 4 С в растворе в течение месяца препарат сохраняет 507 активности. 4 з ° и. ф-лы.

1339128

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения люциферазы светляков, Цель изобретения — увеличение активности и стабильности люциферазы и повышение ее концентрации в растворе, Способ осуществляют следующим образом, Лампочки светляков измельчают растиранием, которое целесообразно проводить в смеси с охлажденным карборундом, что повышает степень измельчения, Полученный порошок инкубируют в 0,1 М фосфатном или трис-ацетатном буферном растворе с рН 7,8. Ис. пользуемый буферный раствор содержит

О, 3-0, 8 M минеральной соли, обычно исПользуемой при работе с ферментами, например хлорид калия или натрия, азотнокислый натрий, а также 15-257. глицерина или 0,2-0,3 М сахарозы в качестве стабилизирующих люциферазу добавок. Соотношение лампочки светляков:буферный раствор 1:(8-30).

Инкубирование ведут 12-24 ч при 4 С, Наличие в буферном растворе высокой концентрации соли и стабилизирующих добавок стабилизирует люциферазу и способствует более полному выделению фермента в раствор иэ исходного сырья

При использовании концентрации соли и стабилизирующих добавок ниже указанных снижаются стабилизирующий эффект буферного раствора и степень извлечения фермента из исходного сырья, Использование концентраций выше максималЬных не приводит к дополнительному положительному эффекту, однако повышает вязкость растворов и затрудняет работу при пониженной температуре. Использование при инкубировании более высокого соотношения лампочки светляков:буферный раствор, чем 1:30, приводит к разбавленным растворам фермента и снижению положительного эффекта изобретения, а при использовании соотношения менее, чем 1:8, приводит к неполному извлечению люциферазы иэ исходного сырья.

Длительность инкубирования менее

12 ч приводит к неполному извлечению люцифераэы, а при длительности инкубирования более 24 ч не достигается дополнительный положительный эффект, однако неоправданно увеличивается длительность всех операций получени люциферазы.

После инкубирования смесь центрифугируют при 3000g 5-15 мин для отделения раствора от осадка. Последний смешивают с новой порцией буферC) ного раствора, перемешивают 2040 мин, вновь центрифугируют, затем обработку осадка повторяют. Три порции буферного раствора, содержащие люциферазу, объединяют и очищают от балластных веществ дифференциальным ультрацентрифугированием, сначала при 20000-30000g 15-45 мин, а затем при 14000g 1-2 ч, Получают надосадочный раствор, который содержит люциферазу с активностью (3, 3-10) ° 10 мВ/мл и удельной активностью (1,6-13)

«10 мВ/мг. Укаэанный режим дифференциального ультрацентрифугирования не является существенным признаком предлагаемого изобретения, а лишь предпочтительным, так как положительный эффект, т,е, повышение активности и стабильности люциферазы, 25 может быть достигнут и при использовании других режимов дифференциального ультрацентрифугирования, а именно: при центрифугировании в одну стадию при 140-150 тыс, g в течение 3 ч, либо при центрифугировании в три или четыре стадии по 30 мин при 15, 50, 100 и 140 тыс, g, Однако во всех этих случаях увеличивается продолжительность и трудоемкость про35 цесса получения люциферазы.

В результате очистки методом дифференциального ультрацентрифугирования достигают 10-кратной очистки фермента от балластных веществ. Таким

40 образом, получают препарат люциферазы, удельная активность которого в

200-2000 раэ выше, чем активность препарата, получаемого по известному способу, а концентрация активной люцифера45 зы выше в 40-130 раз, Полученный по предлагаемому способу препарат люциферазы отличается высокой стабильностью, За счет стабилизирующего воздействия буферного раствора, исполь50 эуемого при выделении фермента, не происходит инактивация люцифераэы в ходе очистки. Полученный препарат о при 4 С хранят 30 дн, при этом активность люцифераэы уменьшается только в 2-3 раза.

Пример 1. 2,2 r лампочек светляков растирают в смеси с 14 r карборунда 20 мин при 4 С, затем добавляют 5 мл охлажденного О, 1 М трис!

3 339 ацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 0,6 M КС1, 20 . глицерина, и растирают еще 20 мин, Добавляют

17 мп того же буферного раствора и о

5 инкубируют 18 ч при 4 С, Таким образом, соотношение лампочки светляков: буферный раствор 1: 10 Смесь центрифугируют при 3000g 10 мин, отделяют раствор, к осадку добавляют 20 мл свежего буферного раствора того же состава, инкубируют 30 мин, вновь центрифугируют, Последнюю операцию инкубирования и центрифугиронания повторяют, Три порции полученного надосадочного раствора объединяют и центрифугируют 30 мин при 25000g, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость центрифугируют при 140000g

1,5 ч, Получают надосадочный раствор, который содержит люциферазу с активностью 1,0 10 мВ/мл и удельной ак9 тивностью 13 1О мВ/мг белка, Степень очистки исходного экстракта после дифференциального ультрацентрифугиро- 25 вания состанляет 16 раз. При хранео нии при 4 С в растворе 30 сут, препарат сохраняет 50% актинности, По известному способу получают препарат люцифераэы с активностью 7,5 10 мВ/мл, зО удельной активностью 8.10 мВ/мг, При хранении препарата при 4 С он полностью теряет активность за 10 сут, Пример 2, Способ осуществляют аналогично примеру 1, но инкубиро35 ванне проводят н буферном растворе, содержащем О, 3 M NaC1 1О глицерина, при несовом соотношении лампочки снетлякон:буферный раствор 1:30 в течение 12 ч, Дифференциальное ультра- 4О центрифугиронание проводят сначала при 15000g 15 мин, а затем при

140000g 1 ч. Получают препарат люциферазы с активностью 3 10 мВ/мл и удельной активностью 3,5 10 мВ/мг

45 белка, При хранении в растворе при

4 С препарат сохраняет через 30 сут

35 активности, Пример 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1 но инкубиро1

50 нание проводят н буферном растворе, содержащем 0,8 M NANO> и 25 глицерина, при соотношении лампочки светляков:буферный раствор 1:8 24 ч, а дифференциальное ультрацентрифугиро55 вание проводят 45 мин при 30000g затем при 140000g 2 ч ° Получают препарат люпиферазы с активностью 3,3 « л10 мВ/мл и удельной активностью

128

1,6 10 э мВ/мг белка. 11олученный препарат при хранении в растворе при

4 С через 30 сут, сохраняет 45 активности.

Пример 4, Все операции осуществляют аналогично примеру 1, но инкубиронание проводят в буферном растворе, содержащем нместо глицерина различные концентрации сахарозы:

0,2, 0,25 и 0,3 М. Получают препараты люцифераэы с активностями

5 10, 10 10 и 6 10 мВ/мл соответственно, Удельная активность препарата люцифераэы, полученного при использовании 0,25 М сахаоозы, 10 " .!О мВ/мг белка. Степень очистки

9 исходного экстракта после дифференциального ультрацентрифугирования

16 5 раз. При хранении при 4 С в растворе через 30 сут препарат сохраняет 50Х активности.

Пример 5. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но растирают лампочки светляков без карборунда и инкубирование осуществляют в

0,1 M фосфатном буферном растворе.

Получают препараты люциферазы с активностью 0,5 .10 мВ/мл. Препарат сохраняет 50 активности через 30 сут. хранения при 4 С, Пример 6, Способ осуществляют аналогично примеру 1, но ультрацентрифугирование проводят 3 ч при

150 тыс. g. Активность полученного препарата 0,7 .10 мВ/мл. Препарат сохраняет 50 активности через 30 сут хранения при 4 С, Пример 7, Способ осуществляют аналогично примеру 1, но ультрацентрифугиронание проводят последовательно при 15, 50, 100 и 140 тыс. g по 30 мин. Активность полученного препарата 0,5 -10 мВ/мл, Препарат сохраняет 40 активности через 30 сут. хранения при 4 С.

Пример 8, Препарат, полученный аналогично примеру 1, используют для определения низких концентраций

АТФ, Для этого в кювету для измерения,биолюминесценции помещают 0,9 мл

0,1М трис-ацетатного буферного раствора, рН 7,8, 0,1 мп О,! М MgS0< в том же буферном растворе, 0,15 мл раствора, содержащего АТФ, 0,2 мл раствора полученного препарата люцифераэы, предварительно разбанленного в 30 раэ буферным раствором указан1339128 свечения I. Разность I-1,„характеризует интенсивность свечения анали-. зируемого образца АТФ I „,„„ . Используя растворы, содержащие различ5 ные концентрации АТФ, получают следующую з ави си мост ь:

Концентрация АТФ в измеряемой смеси, M

10- " 10-" 10 - 10 10

0,8 1,4 3,8 39,4 326,4 обреа u,a !

Полученные данные используют для построения калибровочной кривой для определения неизвестных концентраций

АТФ, Таким образом, предлагаемый способ получения люциферазы позволяет получать препараты люциферазы с

20 удельной активностью, в 200-2000 раз превышающей активность известных препаратов, при этом концентрация люцифераэы в растворе увеличивается в 40-130 раз °

Стабильность полученного растворимого препарата люциферазы в десятки раз превышает стабильность всех известных растворимых препаратов люциферазы. Дополнительным положительным эффектом предлагаемого способа получения люциферазы светляков является увеличение чувствительности определения АТФ с использованием полученного препарата люциферазы, Предел обнаружения АТФ с помощью полученного препарата 10 " М, Формул а и з о бр е те ния

1, Способ получения люцифераэы

40 светляков, предусматривающий измельчение лампочек светляков, инкубирование полученного порошка в буферном растворе, отделение твердого осадка и очистку от балластных веществ, о т—

«45 л и ч а ю шийся тем, что, с це5. Способ по п. 1, о т л и ч а— ю шийся тем, что в качестве ми" неральной соли используют хлорид калия или натрия, или азотнокислый натрий.

Составитель Т. Мелентьева

Редактор И. Горная Техред M.Дидык Корректор И, Эрдейи

Заказ 4183/17 Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 ного состава, Смесь перемешивают, помещают в кюветное отделение люминометра, измеряют фоновую интенсивность свечения I,„, затем добавляют 0,15 мл

0,1 мМ люциферина в том же буферном растворе и измеряют интенсивность лью увеличения активности и стабильности люцифераэы и повышения ее концентрации в растворе, для инкубирования используют буферный раствор, содержащий 0,3-0,8 М минеральной соли, 15-25 глицерина или 0,2-0,3 М сахарозы в качестве стабилизирующих добавок, при этом массовое соотношение лампочки светляков:буферный раствор устанавливают 1:(8-30), а очистку от балластных веществ осуществляют дифференциальным ультрацентрифугированием.

2, Способ по п. 1, о т л и ч а ю шийся тем, что инкубирование осуществляют в течение 12-24 ч в

0,1 М трис-ацетатном буферном растворе, 3. Способ по пп. 1 и 2, о т л ич а ю шийся тем, что дифференци" альное ультрацентрифугирование проводят сначала при 20-30 тыс. g в течение 15-45 мин, а затем при 140 тыс. g в течение 1-2 ч, 4. Способ по пп. 1-3, о т л и ч а ю шийся тем, что лампочки светляков измельчают в смеси с карборундом,