Способ выделения над-зависимой формиатдегидрогеназы

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам выделенияНАД-зависимой формиатдегидрогеназы (КФ1.2.1.2). Цель изобретения - увеличение удельной активности препарата и упрощение процесса. Фермент выделяют следующим образом: экстракт, приготовленный разрушением клеточной суспензии, осаждают сульфатом аммония до насыщения 40%, а супернатант без обессоливания подвергают гидрофобной хроматографии в условиях нисходящего градиента ионной силы на носителе, содержащем в качестве заместителя октильную группировку. Удельная активность препарата 11 мкмоль/мин.мг. Выход 53%. Для достижения большей степени очистки проводят дополнительную очистку методом разделения белков по молекулярной массе. После очистки гель-проникающей хроматографией получают препарат фермента с удельной активностью 15 мкмоль/мин.мг и выходом 40%. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5D g С 12 N 9/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬ1ТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4272104/31 — 13 (22) 30.06.87 (46) 15 05.89. Бюл. № 18 (71) Институт биохимии им, A.H.Баха, ! 1ГУ им. Г1.В.Ломоносова и Научно-производственное объединение Фермент" (72) И,В.Березин, P.К.Вяйткявичус, A. — Ñ.À.Ãëåìæà, A.Ã1.Åãoðoâ, В.А.Кадушевичюс, В.С.Ламзин, P.!1.Ïeòêÿâè÷åíå, В.О.1!опав и В,И.Тишков (53) 577.15(088.8) (56) 1low С Т., Pate! R.N., Las—

kin А.L., Barnade N., !AD-I.inked formate denydrogenase f rom methanol

grown Pichia pastoris !RRL-Y-7556,—

Arch, Biochem. Binphys. 1982„ v. 216, № 1, 296-305.

Egorov A.M,, Avilova Т.V., Djc—

kov M.И., Popov V.0., Rodionov Yu. V., Beresin I.V. NAD-Dependent formate

dekydrogenase from methylotrophic

bacterium, strain 1, Гцг. — .J. Bio—

chem. 1979, ъ. 99, № 3, 569-576. (54) СПОСОБ ВЬ!ДЕЛЕН1!Я НАД-ЗАВИСРМОЙ

ФОРМИАТД1;ГИДРОГЕНАЗЫ

Изобретение относится к биохимии и касается способа выделения и очистки НАД-зависимой формиатдегидрогеназы (КФ 1.2,1.2.), которая является базовым ферментом для создания на ее основе систем регенерации кофактора (НАД11), которые в свою очередь могут быть использованы в тонком органическом синтезе, биохимическом анализе, медицинской диагностике.

Цель изобретения — увеличение

I удельной активчости препарата и упрощение процесса.

„„Я0„„14795!!2 А1 (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именна к способам выделения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы (КФ 1.2,1,2). Цель изобретения— увеличение удельной активности препарата и упрощение процесса. Фермент выделяют следующим образом. экстракт, приготовленный разрушением клеточной суспензии, осаждают сульфатом аммония до насыщения 407,, а супернатант без обессоливяния подвергают гидрофобной хроматографии в условиях нисходящего градиента ионной силы на носителе, содержащем в качестве заместителя октильную группировку, Удельная активность препарата 11 мкмоль/

/мин мг. Выход 53Å. Для достижения большей степени очистки проводят дополнительную очистку методом разделения белков по молекулярной массе, После очистки гель-проникающей хроматографией получают препарат фермента с удельной активностью 15 мкмоль/

/мин мг и выходом 407.. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

Способ осуществляют следующим образом.

Экстракт, приготовленный разруше.нием клеточной суспензии в ультразвуковом дезинтеграторе или разрушением замороженных клеток на Х-прессе или другим соответствунл! IM способом, осаждают 40%-ным сульфатом аммония, а супернатант подвергают гидрофобной хроматографии, используя в качестве сорбентя носители, содержащие в качестве заместителей октильную группи— ровку (октил-сефяроэя, октил-сило1479512хром, октил — агароза) в условиях нисходящего градиента ионной силы элюирующега буфера. Удельная активность полученного препарата составляет

1 1 MKMOIlb/MICH мг, пользовать его в практике. Основными примесными компонентами после стадии гидрофобной хроматографии являются низкомолекулярные пигменты и два бел- 10 ка с молекулярными массами около 150 и 10-?5 кДа соответственно. Для достижения большей степени очистки целесообразно дополнительно провести очистку методом, позволяющим разделить белки по молекулярной массе, например, последовательным пропусканием препарата через мембраны (полые волокна) с отсекающей молекулярной массой около 100 и 30 кДа соответствен- 20 но или гель-фильтрацией на носителях, позволяющих осуществлять фракционирование белков в диапазоне молекулярных масс 20-200 кДа (например, Тойоперл

НИ55 (Тойо-Сода, Япония), Сефакрил 25

$-200, Сефадекс G-200 (Фармация, 1.:1веция), ультрагель АсА-44 (I.ÊÂ, 11 веция)).

Все стадии выделения и очистки проводят в присутствии 0,01 М ЭДТА в качес rвe стабилизатора ферментативнои активности. После очистки гель-проникающей хроматографией получают препарат фермента с выходом 40 . и удельной активностью 15 мкмоль/мин.мг.

Пример 1. 50 r клеток FseuЪ

domonas sp.101 суспендируют в 50 мл

0,1 M калий-фосфатного буфера, 0,01 M

ЭДТА, рН 7,8. Разрушение проводят на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН в положении максимального резонанса (частота 20 кГц, мощность 0,3 Вт) в течение 20 мин при охлаждении. Температура клеточной суспензии не должна .о превьпнать 15 . Охлаждение наружное (ванна со льдом It солью) . AKTFIBFtocTh

45 фермента после разрушения 6000 мкмоль/

/мин. Удельная активность 0,6 мкмоль/

/мин ° миг, К разрушенной клеточной суспензии добавляют при необходимости препарат

ДНК-азы для разрушения нуклеиновых кислот, увеличивающих вязкость суспензии, и оставляют на 30 мин.

Клеточную суспензию центрифугируют 60 мин при охлаждении при 15000g для удаления крупных клеточных и субкл To÷íbot частиц, Активность фермента 5500 мкмоль/мин. Удельная активность 0,6 .мкмоль/мин тамг.

К гомон енГГту ГГорГгиями при постоянном перемешивании добавлякл .Гасыщенный раствор сульфата аммония в

0,05 И калий-фосфатном буфере, 0,01 1 1

ЭДТА, рН 7,8 до конечной концентрации сульфата, равной 40 ., Через 12 ч раствор центрифугируют 30 мин при охлаждении при 15000g, Осадок отбрасывают. Активность фермента 4900 мкмоль/мин ° Удельная активность 0,7 мкмоль/мин ° мг.

Свежий или регенерированный носитель (октил-сефароза CI.-4В, Фармация, Швеция) помещают в колонку 50 х 100 мм объемом около 200 мл и уравновешивают его 0,03 M калий-Aoñôàòíûì буфером, 0,01 М ЭДТА, 30% сульфат аммония, рН 7,8.. Раствор фермента наносят на колонку со скоростью от 2 до

10 мл/см .ч и промывают исходным буфером, После элюции белков, не сорбируГощихся на гидрофобном носителе, формиатдегидрогенаэу элюируют линейными нисходящим градиентом 30 -ного сульфата аммония в 0,03 M калий-фос-. фатном буфере, 0,01 М ЭДТА, рН 7,8, суммарным объемом 500 мл. Объединяют фракции фермента с удельной активностью от 9 до 11. Фракции с удельной активностью от 5 до 9 могут быть использованы при очистке гидрофобной хроматографией следующей партии фермента. Активность фермента

2900 мкмоль/мин. Удельная активность

10 мкмоль/мин. мг.

Пример 2. Способ осуществляют согласно примеру 1, но после стадии гидрофобной хроматографии объединенные фракции фермента концентрируют до объема 25 мл ультрафильтрацией, используя мембраны или полые волокна с отсекающей молекулярной массой

10 кДа. Раствор фермента наносят на колонку объемом 1,5 л (50 х 750 мм) с сефакрилом $-200, уравновешенным

0,05 М калий-фосфатным буфером, 0,01 И

ЭДТА, рН 7,8. Скорость нанесения формиатдегидрогенаэы до 2 мл/см ° ч. Формиатдегидрогенаэа элюирует в объеме

800-1100 мп, Объединяют фракции с удельной активностью от 14 до 16.

Фракции с удельной активностью от 9 до 14 могут быть использованы при очистке гель-проникающей хроматографией следующей партии фермента. Активность фермента 2200 мкмоль/мин °

Удельная активность 15 мкмоль/мин MI, Выход 40 ..

-1479512

))римсрьt 1 и,. иллнм трируются таблицей.

Пример 3. Способ осуществляют согласно примеру 2, но дезинтеграцию проводят на Х-прессе. 50 г разморо-, женных клеток Pseudomonas sp.101 помещают в ячейку для разрушения, которую замораживают жидким азотом или смесью сухого льда с ацетоном. Разрушение производят постепенно повышая давление до .10 т/см . Процедуру разрушения повторяют два раза. Удельная активность 15 мкмоль/миг мг. Выход

35 .

Пример 4. Способ осуществляют согласно примеру 2, но дезинтеграцию проводят перетиранием клеток со стеклянными бусами. 50 г клеток суспендируют в минимальном объеме 0,1 М калий-фосфатного буфера, 0,01 M ЭДТА, рН 7,0 и добавляют равный объем стеклянных бус (шариков) диаметром 0,30 5 мм. При 1700 об/мин время разрушения составляет 20 мин. Удельная активность 15 мкмоль/мин мг. Выход 35 ..

Пример 5. Способ осуществляют согласно примеру 2, но на стадии гидрофобной хроматографии вместо октилсефарозы используют октил-силохром.

Колонку с носителем (220 мл) уравновешивают 0,1 M калий-фосфатным буфером, 0,01 И ЭДТА, 40/ — ным сульфатом аммония, рН 7,0. Препарат фермента промывают 2 л 0,1 Г! калий-фосфатного буфера, 0,01 M ЗДТА, 30 -ным сульфатом аммония, рН 7,0 и элюируют линейным нисходящим градиентом общим объемом 1000 мл 30%-ного сульфата аммония в О, 1 М калий-фосфатном буфере, 0,01 М ЭДТА, pF 7,0. Скорость элюции составляет до 10 мл/см, ч. Объединяют фракции с удельной активностью более

9 мкмоль/мин мг. Удельная активность

13 мкмоль/мин мг. Выход 35 a.

Пример 6, Способ осуществляют согласно примеру 1, но вместо клеток

Pseudomonas sp. 101 берут клетки Candida methylica. Общая активность фермента в бесклеточном экстракте после разрушения 50 г клеток составляет

1000 мкмоль/мин. Удельная активность собранных фракций после гидрофобной хроматографии — 8 мкмоль/мин мг. Общая активность 500 мкмоль/мин, Выход 50 .

Пример 7. Способ осуществляют согласно примеру 2, но на стадии гидрофобной хроматографии вместо ок15

55

35 тил — сефарозы используют октил-агарозу (Сигма, США) . Колонку с носителем

1 (200 мл) уравновешивают 0,1 И калийфосфатным буфером, 0,01 M ЗДТА, 40 — ным сульфатам аммония, рН 7,0. Препарат фермента наносят на колонку, промывают 500 мл исходного буфера и элюируют линейным нисходящим градиентом общим объемом 500 мл 40 -ного сульфата аммония в 0,1 И калий-фосфатном буфере, 0,01 И ЭДТА, рН 7,0.

Скорость элюции составляет 0,51,0 мл/см ° ч, Удельная активность

10 мкмоль/мин мг. Выход 30%.

Пример 8. Способ осуществляют согласно примеру 1. Далее после стадии гидрофобной хроматографии объединенные фракции фермента очищают путем разделения по молекулярным массам методом ультрафильтрации с использованием мембран "Амикоп (Голландия). К исходному раствору по мере его фильтрации добавляют 1 объем (от 50 до 100 мл) 0,05 M калий-фосфатного буфера, 0,01 И ЭДТА, рН 7,8.

На первом этапе используют мембраны

ХМ вЂ 1 с отсекающей молекулярной массой 100 кДа. На втором этапе элюат очищают и концентрируют с испсльзованием мембран PH-30 с отсекающей молекулярной массой 30 кДа. Уд льная активность фермента 12 мкмоль/мин мг.

Выход 203. !

Формула изобретения

1. Способ выделения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы, включающий фракционирование сульфатом аммония гомогената клеток микроорганизма-продуцента с последующей хроматографической очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью увеличения удельной активности препарата и упрощения процесса, очистке подвергают супернатант, полученный после осаждения сульфатом аммония, а хроматографическую очистку выполняют методом гидрофобной хроматографиии в условиях нисходящего градиента ионной силы на носителях, имеющих в качестве заместителей октильную группу.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что осаждение сульфатом аммония ведут до степени насыщения 40%.

1479512

3. Способ по п.1, о т л и ч а ю— щ и й. с я тем, что после гидрофобной хроматографии осуществляют дополнительную очистку методом разделения белков по Молекулярной массе.

Очистка, раэ

Стадия очистки Общий Общая ак- Удельная белок, тивность, активность, мг мкмоль/мин мкмоль/мин-мг

Выход по активности, 7

Г>егклеточный

О,б

8700 5500

100

7000 4900

0,7

1,1 . 90

?90 2900

53 щая хроматография на сефакриле

145 2200

40

П р и м е ч а н и е, Очистка бактериальной формиатдегидрогеназы на

50 r биомассы Fseudomonas sp,101.

Редактор N.Недолуженко

Заказ ?504/25 Тираж 501. Подписное

БНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ. СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,!01

i зксTpRK!

Фракционирование 4И сульфатом аммония

Гидрофобная хроматография на октил-сефарозе

Гель-проникаюСоставитель А,Семенов

Техред М.Ходанич Корректор N.Èàêñèìèøèíåö