Способ определения дыхательной активности микроорганизмов

 

Изобретение может быть использовано в биотехнологии при производстве препаратов путем микробиологического синтеза. Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа. В кварцевую пробирку вносят 0,1 мл исследуемой пробы с E.COLI М-17 в виде водной суспензии с концентрацией клеток 10<SP POS="POST">9</SP> микробных тел в 1 мл и 10 мкл бычьего сывороточного альбумина, ковалентно связанного с цинкпротопорфирином IX. Концентрация белка 1 мг/мл, соотношение белок - флуорохром 1:10 (в молях). Пробу помещают в кюветное отделение флуориметра с временным разрешением, облучают видимым светом от лампы накаливания и регистрируют фотоприемником кинетику изменения сигнала длительной люминесценции с &Tgr;*9810<SP POS="POST">-4</SP> с в процессе поглощения кислорода. Способ заключается во введении длиннолюминесцирующего (с &Tgr;*9810<SP POS="POST">-4</SP> с) флуорохрома на носителе и измерении кинетики изменения сигнала с последующей оценкой результата по формуле. 1 ил., 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) (51)5 С 12 q 1/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 4,5 о К 2,2 Дс, — 0,8Лс2 где К

Д, пробы после поглощения из среды кислорода); интервал времени, соответствующий возрастанию интенДс

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4426085/31-13 (22) 16.05.88 (46) 30.10.90. Бюл. 11=- 40 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (72) Н, С. Осин (53) 577.15(088.8) (56) Петухов В. Г,, Осин Н. С. Длительная люминесценция микроорганизмов: природа и применение, — успехи микробиологии, 1989, т. 23.

Авторское свидетельство СССР

)1у 1339130, кл ° С 12 () 1/02, 1987. (54) СПОСОБ ОПРЕДБЛЕ1ПИ Д)4ХАТЕЛЬНОИ

АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ (57) Изобретение может быть использовано в биотехнологии при производстве препаратов путем микробиологического .синтеза. Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощеИзобретение относится к микробиологии и может найти применение в биотехнологии при производстве препаратов путем микробиологического синтеза.

Цель изобретения — повышение чувст. вительности способа и его упрощение.

Способ заключается в том, что в пробу вводят длиннолюминесцирующий (со(, 10 с) флуорохром на носителе ковалентно и/или сорбционно связанный с ним, рег" ."трируют кинетику изменения уровня сигнала длительной люминесценции, а дыхательную активность рассчитывают по формуле

2 ние способа. В кварцевую пробирку вносят 0,1 мл исследуемой пробы с Е. coli M-17 в виде водной суспензии с концентрацией клеток 10 микробных тел в

1 мл и 10 мкл бычьего сь вороточпого альбумина, ковалентно связанного с цинкпротопорфирином IX. Концентрация белка 1 мг/мл, соотношение белок— флуорохром 1:1О (в молях). Пробу помещают в кюветное отделение Алуорпметра с временным разрешением, облучают видимым светом от лампы накаливания и регистрируют фотоприемником кинетику изменения сигнала длительной люминесценции с о ) 10 с в процессе поглощения кислорода, Способ заключается

Щ во введении длиннолюминесцирующего (с > 1й с) рлуорохрома на носителе и измерении кинетики изменения сигнала с последую1ней оценкой результата по формуле. 1 ил,, 1 табл. константа тушения флуорохрома кислородом; интервал времени, за который уровень длительной люминесценции увеличился от

0,1 Io до 0,2 I (I — уровень максимального свечения

1602869 сивности люминесцении с

О ° 1 Х до О 5 Ig °

В качестве флуорохромов используют широкий набор длиннолюминесцирующих соединений (ароматические углеводоро5 ды, гетероциклические соединения, например порфирины и их металлокомплексы, пирен, бензопирен, флавины и их производные). В качестве носителей используют белки, ковалентно или адсорбционно связанные с флуорохромом, латексные частицы и другие сорбенты.

Использование в качестве индикатора флуарохрома на носителе резко уве- 1 личивает его способность к длительной люминесценции за счет устранения тушащего действия воды.

Предлагаемый способ обеспечивает повышение чувствительности, Это обеспечивается двумя факторами: исключением дозирования кислорода с помощью водного раствора и введением в пробу индикатора с известной характеристикой тушения кислородом его длительной 5 люминесценции. Введение этих операций позволяет резко уменьшить объем анализируемых проб до единиц микролитров, т.е. повысить чувствительность анализа.

Оптимальным диапазоном для регистрации Х, I, Т .является диапазон от

О, 1 Т до 0,5 Ip. 3TQ cBR3GHo с тем, что при I C 0,1 1 возрастает ошибка от вклада длиннолюминесцирующих примесей, а.при I > 0Ä1 I у микро35 организмов может существовать альтернативный путь поглощения кислорода, вклад от которого заметен лишь при крайне низких концентрациях кислоро40 да.

Вклад, альтернативного пути погло- щения кислорода становится заметным при I ) 0 5 Х, т.е. при концентрациях кислорода, много меньших конс- 45 танты Михаэлиса основного пути.

Способ поясняется следующими при мерами.

Пример 1. Металлопорфирин (флуорохром) растворяют в воде (10 М)

50 и смешивают с карбодиимидом в соотношении 1:2 (М), после 30 мин инкубации при комнатной температуре в реакционную смесь добавляют белок (бычий сы» вороточный альбумин) в молярном отно55 шенин 10! 1 (флуорохром. белок) . Через

4 ч инкубации гельфильтрацией на колонке с сефадексом G-50 отделяют конь" югат от свободного (несвязавшегося) металлопорфирина. В качестве элюента используют трис-буфер (рН 7,2). Конъю" гат (флуорохром-белок) разливают по отдельным ампулам и высушивают лиофильно..

Пример 2. Один из флуорохро мов (эозин, бензопирен, пирен, металлопорфирин) растворяют в воде (10" N) и смешивают с меламинАормальдегидной смесью по известному способу. Затем проводят отмывку латексов от несвязавшегося флуорохрома седиментацией или центрифугированием. Латексы хранят в виде водного раствора.

: Пример 3. Латексы с флуоресцентной меткой на основе полистирола получают смешиванием Алуорохрома с эмульсией стирола с последующей его полимеризацией.

Затем реакционную смесь освобождают центрифугированием или седиментацией от свободного флуорохрома. Латек . сы хранят в виде эмульсии или лиофиль но высушенных частиц.

Пример 4. В кварцевую пробирку вносят 0,1 мл исследуемой пробы с Е. coli M-17 в виде водной суспензии с концентрацией клеток 10Э микробных тел в мл (м.т./мл) и 1О мкл бычьего сывороточного альбумина, ковалентно связанного с цинкпротопорфирином IX, Концентрация белка 1 мг/мл, соотношение белок:флуорохром 1:10. (в молях).

Пробу помещают в кюветное отделение флуориметра с временным разрешением, облучают видимым светом (400700 нм) от лампы накаливания марки

КГМ 15 Вт и Аотоприемником ФЗУ-114 регистрируют кинетику изменения сигнала длительной люминесценции (с с > о 10 с) в процессе поглощения кислорода.

На чертеже представлена кинетика (A) изменения сигнала длительной люминесценции в процессе поглощения кислорода.

Находят время увеличения сигнала с0,1 до 0,2 I è до 0,5 I ðàâíîå 1,и

2 мин соответственно. С учетом кон« станты тушения К qдля цинкпротопорфирина IX, равной 1,6 - 10 м, по Аормуле получают величину дыхательной активности микроорганизмов в пробе, рав ную 0,47 ° 10 М 1СД /мин ° 10 > м. т.

Пример 5. Способ осуществляют аналогично примеру 1. В качестве .флуорохрома используют пирен, в каче5 160286 стве носителя — частицы поли.тирола

1 диаметром 5-20 мкм. Концентрация пирена в пробе 10 И.

На чертеже представлена кинетика (Ь) изменения сигнала длительной люминесценции флуорохрома в процессе поглощения кислорода из пробы. С учетом константы тушения для данного флуорохрома Н = 8 ° 10 м а времена 6t

0,57 мин, = 1,08 мин расчетом го, ормуле находят дыхательную активность микроорганизмов в пробе, равную

0,47 ° !О М (О )/мин < 10 мета

Из срав итьных д ь|х примеров 1 15 и 2 видно, что независимо от типа испольэуемого флуорохрома и носителя скорость поглощения кислорода в обоих случаях оказалась равной.

Пример 6. Ампулу с вакциной 20

БЦЖ (1 мг сухой биомассы) вскрывают и разводят дистиллированной водой (0,2 мл). После регистрации в течение

15 мин суспенэию микроорганизмов лереносят в измерительную ампулу диаметром 25

5 мм и вносят 10 мкл меламинформальдегидных латексов (2,5 10 мл) с трипафлавином (3 . 10 M). Время восстановления люминесценции от 0,1 I „ „, до уровня 0,2 I дд составило 9 мин, à 30 до уровня 0,5 Iчо 16 мин соответственно. С учетом константы тушения К

2 ° 107 м для трипафлавина скорость поглощения кислорода, рассчитанная по формуле, составляет

9 6 минесценции (с ь ) 10 " с) в процессе поглоц|ения кислорода. На чертеже пред ставлена кинетика (В) изменения сигнала в процессе поглощения кислорода, Расчетом по формуле с учетом Qt, = 2 мин, а At, = 4 мин и константы тушения для данного флуорохрома, равной K = 1,8 10 м, находят дыха7 -1 тельную активность микроорганизмов в пробе, равную 2,8 10 М ОД/мин х 10 м.т.

В таблице представлены данные по сравнительной с известным способом оценке чувствительности предлагаемого.

В качестве флуорохрома на носителе испольэовали Al(OH) на бычьем сывороточном альбумине.

Из .данных таблицы видно, что предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность анализа за счет резкого уменьшения объема анализируемых проб. При уменьшении объема пробы с

1 мл до 0,1 мл в прототипе заметно увеличивается ошибка определения, связанная с некорректностью приема дозирования кислорода.

Таким образом, предлагаемый способ может быть использован для решения различных задач в области биотехнологии, где необходимо производить оценку дыхательной активности в малых объемах проб с низкой концентрацией клеток или с низким уровнем дыхательной активности.

К

4,5 о 2 ° 1Ог 2,2 ° 9 — 0,8 ° 16

0 5 - 10 т 4,5

f9,8 — 10,8

0,25- 10 М ГОг1 /мин/мг сух, массы

Пример 7. В кварцевую пробирку диаметром 2 мм вносят 5 мкл пробы, содержащей 10 клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae и 2 мкл конъюгата бычьего сывороточного альбумина с Al(OH)-компропорфирином в концентрации 10 мг/мл и молярном соотношении белок:порфирии 1:10.

Пробирку с пробой помещают в кюветное отделение флуориметра с временным. разрешение.-, облучают видимым светом от лампы накаливания КГМ 15 Вт и фотоприемником ФЭУ-114 регистрируют кинетику изменения сигнала длительной лю4

Формула изобретения

Способ определения дыхательной активности микроорганизмов путем введения в пробу флуорохромов, облучения пробы светом и регистра1цп кинетики измене сигнала длительной люминесценции с последующей оценкой результа. та, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения анализа, иэ флуорохромон используют длиннолюминесцирующий флуорохром с . 10 с на носителе., а оценку результата ведут по формуле

Vo

К, 2,2 Ьс — 0,8 $t,. где V — дыхательная активность;

- конставта тушения люминесценции,флуорохрол1а кнслоро-1 дом, м

1602869 (((t — интервал времени, соответствующий увеличению сигнала люминесценции от О, 1 I8 до

0,2 I ., I — максимальный уровень люминесценции пробы после поглощения кислорода; — интервал времени, соответст-, вующий увеличению уровня люминесценции от 0,1 Х до

0,5 I> °

Результаты анализа по способу лагаемому

Е. coli М-17.Е. coli М-17

0,5

E..coli M-17

0,1

E. coli M-17

0,005 Не определяется

Sacch. cerevisiae

0,005 Alcaligenes faeca118

0,2 - 10 М ОД/ мин ° 10 м. т.

О, 005

1 46 г

/ (у"

/

4У

0,0 (1 5 4 5 6 7 Ф/9ин

Заказ 3360 Тираж 484 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР .113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г.ужгород, ул. I àãàðèíà,1 1

tl 11

101, 0,52 10 И ОД / мин 10 м.т.

0,60 ° 10 И(ОДi мин 10 м.т.

0,75 10 И ОД / мин - 10 м.т.

Составитель А. Карякин

Редактор И. Киштулинец Техред Л.Сердюкова Корректор T. Колб

0,47 10 М (О,)/ мин " 109 м.т.

0,47 " 10 И О,)/ мин ° 109 м.т, О ° 48 10 М ГОЭ мин 10 м.т.

0,49 " 10 N (ОД/ мин " 10" и. т.

О 7 -1О И ОД/ мин, 10 м.т.