Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l. - продуцент моноклональных антител к бактериям рода brucella

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине при диагностике бруцеллеза. Цель изобретения - получения штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS L., продуцирующих моноклональные антитела (МонАт) к "кор" липосахариду бруцелл. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мыши линии BALB/с, иммунизированных полисахаридным антигеном из R-формы BRUCELLA MELITENSIS, с клетками миеломмы X63AG8-6.5.3. Штамм депонирован под номером ВСКК/П/ N 303D. Среда культивирования клеток - среда RPMI-1640 с 10% эмбриональной сывороткой теленка, 2<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-3</SP> М глютамина, 1<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-3</SP> пирувата натрия, 5<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-5</SP>М 2-меркаптоэтанола, 1<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-2</SP>М HEPES. 50 мкг/мл гентамицина. Культивирование ведут при 37°С в атмосфере с 5% CO<SB POS="POST">2</SB>. Частота пассирования через 2-3 сут, кратность рассева 1:3-1:4. На 3-4 день культивирования гибридомы концентрации МонАТ составляет 45-50 мкг/мл в культуральной среде и 7 мг/мл в очищенной асцитной жидкости. монАТ относятся к классу JGG, подклассу 2а и специфичны к эпитому "кор" участка полисахаридной цепи бруцелл. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (gl)5 С 12 И 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЬ1Й НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4645016/30 — 13 (22) 30. 12.88 (46) 07. 11.90. Бюл. I " 41 (71) Целиноградский сепьскохозяйстинститут, Институт биооргани— ческой химии и Всесоюзный ваучноисследовательский институт экспериментальной ветеринарии им, Я.P Коваленко (72) А.К. Булашев, В.А. Несмеянов, A.Ф. Дмитриев, К.К. Муканов, Т.Г . Байтубаев, В.А. Ромахов и А.Н. Касьянов (53) 578.085.23(088 .8) (56) Bund . D.R. et а1 — Infection

and Immuni.ty, 1984, 46, 2, р. 389393. (54 ) ЫТАИ1 ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУГЛ 1Х

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ГПУБ MUSCULUS I . — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ I; БА1ТЕРИЯМ РОДА В1ЖCELLA 57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в ветеринарии .и медицине при диагностике бруцеллеза. Цель изобретения — получение штамма гибридИзобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине при диагностике бруцеллеза .

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируе— мых клеток животных Ипз шпзспlus продуцирующих моноклональные аптитетела (МонАТ) к " кор" лппосахариду бруцелл.

„„80„„1604848 А 1 ных культивируемых клеток животных

Itus musculus Ь, продуцирующих моноклональные антитела (МонАТ) к кор 1 липосахариду бруцелл. И1гамм получают гибрпдизацией клеток селезенки мьшп линии ВА?,В/с, иммунизированных полисахарид ым антигеном из Н-формы Вгисе11а melitensis, с клетками миеломмы

X68Ag 8 — 6.5.3. Итамм депонирован под номером BCKK/Ï/ >"- 303Д. Среда культивирования клеток — среда RPIII-1640 с

10/ эмбриональной сывороткой телекка . 2 х 10" М глютамина, 1 х 10 з пирувата натрия, 5 х 10 М 2-меркаптоэтанола, 1 х 10 HEPES. 50 мкг/мл гентамицина. Культивирование ведут при 37 С в атмосфере с 5Х СО>. Частота пассирования — через 2-3 сут, кра.тность рассева 1:3-1:4, На 3-4 день культивирования гибридомы концентрации МонАТ составляет 4550 мкг/мл в культуральной среде и

7 мг/мл в очищенной асцитной жидкости. МонАТ относятся к классу lgG подклассу 2а и специфичны к эпитому

"кор" участка полисахаридной цепи бруцелл. 1 табл.

Штамм получают следующим образом.

Мышам линии BALB/ñ в перьый день иммуни за ции внутрибрюшинно вводят

30 мкг полисахаридного антигена поли — Б, п ол уч енно го из R-ф ормы

Brucella melitensis шт.В-115, в

0,1 мл неполного адъюванта <рейнда.

Поли-Б из R-форм бруцелл не содержит О-специфическую цепь липополисахарида (ЛПС) и состоит из липида А

1604848 и "кор" части полисахарида. На

7 11, 12 и 13 дни иммунизации животным инъецируют по 15 мкг антигена в забуференном физиологическом раство5 ре (ЗФР), рН 7,2-7,3 . Спустя четыре

t дня после последней инъекции, извлекают селезенку тех мышей, которые дают более высокие титры антител по а твердофазному иммуноферментному анализу (ТИФА). Клетки селезенки иммунных мышей в количестве 7,5 х 10 гиб6 ридизуют с 1,5 х 10 клетками миелоф мы X 63Ag 8-6,5.3 в присутствии 1 мп раствора, содержащего 45 полиэтиленгликоля 4000 и 10 диметилсульфоксида в течение 1 мин, После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля высевают их в ячейки 96-луночной панели на слой перитонеальных макрофагов мыши.

Селекцию гибридных клеток проводят на среде, содержащей гипоксантинаминопт ерин-тимидин. Гибриды — пр одуценты клонируют два раза методом лимитирующих разведений, высевая в ячейки 96-луночной панели с питающим слоем перитонеальных макрофагов. После второго клонирования практически 100 субклонов продуцируют анти- 0 тела к тестируемому антителу. Продуктивный клон гибридомы обозначают БИМА.

Штамм БИМА хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером BCKI". (П) Ф 303Д и характеризуется следующими свойствами.

Морфологическая характеристика.

Культура состоит из слабоприкреп- 40 ляющихся к подложке округлых клеток размером с исходную миеломную клетку, Цитоплазма имеет вид тонкого ободка вокруг ядра.

Культуральные свойства 45

Ср еда кул ьтивир ования — ср еда

КРМ1 — 1640 с 10 .-ной эмбриональной сывороткой теленка, 2 х10 М глютамина, 1 х 10 пирувата натрия,. 5 х х 10 М 2-меркаптоэтанола, 1 х 10

M HepeS, 50 мкг/мл гентамицина.

Культивирование штамма ведут при

37,5 С в атмосфере с 5 СО . Характер роста — стационарная суспензия.

Частота пассирования — через 2-3 сут, кратность рассева 1: 3-1: 4. Посевная 55 б концентрация клеток 1-2 х 10 в 1 мл,:

Максимальная клеточная плотность

0,5 мпн/мл.. Культивирование in vivo

При внутрибрюшинной прививке мышам линии BAIB/с штамм гибридомы образует опухоль в асцитной форме на

9-11 дни. Доза клеток при прививке

2 х 10 кл. За 7 дней до введения

6 гибридомы необходимо инъецировать, животным пристан — 2, 6, 70, 14 тетраметилпентадекан в дозе 0,5 мл на головку. Штамм сохраняет способность продуцировать специфические моноклональные антитела в течение

5 пассажей на сингенных мышах (время наблюдения) .

Продуктивность штамма.

На 3-4 день культивирования гибридомы концентрация МКА составляет

45-50 мкг/мл в культуральной среде и

8 мг/мл в очищенной асцитной жидкости.

Характеристика полезного продукта.

МонАТ относятся .к классу IgG noqклассу 2а, Они специфичны к эпитопу

"кор" участка полисахаридной цепи бруцелл. Константа связывания 7,7 х х 10 M.

Методы оценки специфичности МонАТ: непрямой и "сэндвич" варианты ТИФА. иммуноблот, реакция микроагглютина— ции (РМА), Контаминация. Контаминантов линии, включая бактерий, грибы, дрожи и микоплазму, не обнаружено.

Криоконсервация. К осадку гибрид— ных клеток добавляют эмбриональную сыворотку теленка, а затем — димЕтилсульфоксид до конечной концентрации

10 . Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающими крышками по 1 — 5 млн.кл. в объеме 1 мл, помещают в коробку из пенопласта и оставляют на 1 сут при

-70 С, после чего ампулы переносят в о жидкий азот. Замороженные ампулы вынимают из сосуда с жидким азотом и быстро помещают в водяную баню на о

37 С. Как только растают последние кусочки льда, еуспензию клеток переносят стерильной пипеткой в центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной бессывороточной среды, отмывают один раз и засевают в ячейки 24луночной панели с питающим слоем перитонельных макрофагов мышей. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 62%Штамм БИМА используют следующим образом.

1604848

6 ции в течение 1,5 ч при 37 С панель отмывают описанным способом и вносят в ячейки антитела кролика против иммуглобулинов мьппи, конъюгированные

5 с пероксидазой хрена. Через 1 ч повторяют процедуру отмывки с целью удаления несвязанных продуктов реакции, а связавшийся конъюгат, а значит и антитела против антигена бактерий определяют количественно по распаду субстрата - H O в присутствии хромогена — ортофенилендиамина. Положительная реакция характеризуется корич15 невым окрашиванием и просчитывается при 492 нм.

Результаты опыта по определению активности иммуноглобулинов из культуральной среды и асцитной жидкости

20 представлены в таблице, Данные таблицы показывают, что в непрямом варианте ТИФА моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридомы БИМА, реагируют со всеми ис25 пользованными бактериальными антигенами, в том числе с липополисахаридами J.entегоcolitica О:9, имеющими аналогичную химическую структуру с

ЛПС бруцелл.

Титры МонАТ дкости

1: 128

1:64

1:64

1:64

1:64

1:64

1:819 200

1: 204 800

1::204 800

1:204 800

1:409 600

1-.204 ЕОО

Поли-Б Brucella melitensis Â115

Поли-Б Brucella melitensis 16M

ЛПС Brutella abortus 19

ЛПС Brucella abortus 54

ЛПС Brucella melitensis 16М

ЛПС J.entегоcolitica О:9

Пример 1. Гибридные клетки помещают в пластиковый флакон пло щадью 25 см по 5x10-" в 5 мл среды культивирования иинкубируют 3-4 дня при

37 5 С в атмосфере, содержащей 5Ж

СО . Культуральную среду собирают, цейтрифугируют 10 мин при 800g и

4 С с целью отделения клеток от надосадочной жидкости — супернатанта, содержащего антитела. При культивировании гибРидомы in vivo иммуноглобулиновую фракцию из асцитной жидкости получают высаливанием белков сульфатом аммония до 45Х насьпцения с последующим диализом против ЗФР/рН

7,2-7,3 при 4 С в течение ночи, Поо лученные антителосодержащие материалы: супернатант и очищенную асцитную жидкость используют как реагенты для изучения специфичности взаимодействия

МонАТ с тестируемыми антигенами.

Пример 2. Лпя проведения непрямого варианта ТИФА на полистирольную 96-луночную панель для микротитрования сорбируют антигены: липополисахариды и поли †Brucella abortus Brucella melitens Ез „ J. enteгосо1 tica О:9 (1 мкг в 100 мкл

ЗФР, рН 7,2-7,3) при 4 С в течение ночи. Затем панель отмывают три раза

ЗФР и три раза ЗФР с 0 05Х-ным Твином — 20 (ЗФР-Тв), готовят в ячейках панели двукратные разведения супернатанта (1:2 и выше) и очищенной асцитной жидкости (1:100 и выше) в объеме 100 мкл ЗФР-Тв. После инкуба1

Виды бактериальных антигенов

Фор мула из обретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L—, ВСКК(П) ¹ ЗОЗД вЂ” продуцент моноклональных антител к бактериям рода

Brucella.

1 в культураль- в очищеннои ной среде асцитной