Способ оценки биологической активности органических соединений в водных растворах

 

Изобретение относится к медицине, в частности к разделу биохимических исследований, направленных на изучение и выявление механизма биологической активности компонентов биожидкостей и природных вод. Цель изобретения - упрощение способа при одновременном повышении его чувствительности. Способ состоит в том, что исследуемую жидкость вводят в тест-систему, содержащую 2,5 S РНК и по наличию изменений скорости ветвления α-глюканов оценивают биологическую активность органических соединений в водных растворах. Наряду с упрощением и повышением чувствительности способ позволяет сохранить время исследования.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (51)5 С 01 N 33/68

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4444971/28-14 (22) 30.06.88 (46) 07. 11.90. Бюл. № 41 (71) Институт океанологии им. П.П.Ширшова (72) С,В, Харченко, Г.А. Корнеева, А.А. Ветров и Е.A. Романекович (53) 612.015(088.8) (56) Океанология, 1987, т. 27, вып,6, с. 1023-1026.

1 (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ БИОПОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ .В

ВОДНЫХ РАСТВОРАХ (57) Изобретение относится к медицине, в частности к разделу биохимичесИзобретение относится к медицине, в частности к разделу биохимических исследований, направленных на изучение и выявление механизма биологической активности компонентов биожидкостей и природных вод.

Цель изобретения — упрощение способа при одновременном повышении его чувствительности.

Способ осуществляется следующим образом.

Берут 30-35 мкл 0,57.-ного раствора крахмала и добавляют 5-8 мкг 2,5 S

PHK. Объем пробы доводят до 600 мкл

5 мМ натрийкарбонатным буфером, рН о

7,2. Смесь инкубируют 30 мин при 37 С, затем добавляют 1/10 объема 15Х-ной хлорной кислоты„Пробы центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин.

2 ких исследований, направленных на изучение и выявление механизма биологической активности компонентов биожидкостей и природных вод. Цель изобретения — упрощение способа при одновременном повышении его чувствительности.

Способ состоит в том, что исследуемую жидкость вводят в тест-систему, содержащую 2,5 S PHKи по наличию изменений скорости ветвления оС-глюканов оценивают биологическую активность органических соединений в водных растворах. Наряду с упрощением и повышением чувствительности способ позволяет сохранить время исследования.

3 табл.

Отобрав 500 мкл супернатанта, добав ляют к нему 50 мкл 0,01 н. раствора

I + КХ, после чего измеряют экстинкцию при 520 нм на спектрофотометре.

Расчет активности проводят по разности поглощения образца без добавления

2,5 SPHK ив присутствии 2,5 SPHK.Так оценивают исходную активность 2,5 S

РНК. При определении биологической активности компонентов природных вод и биологических жидкостей изучаемый объект вносят в количестве 1-100 мкл (1-100 мкг) в описанную пробу перед ее инкубацией и термостатированием, После определения активности опытного образца инкубационной смеси ее сравнивают с исходной активностью 2,5 S

PHK. По полученным результатам устанавливают уровень биологической активности

1605206

Пример 1. Изучение низкомолекулярных компонентов ротовой биологической жидкости (РБЖ) человека, Низкомолекулярные компоненты РБЖ были взяты для исследования не случайно.

Было показано, что при развитии злокачественных новообразований в РБЖ больных людей появляются специфические метаболиты с мол. массой 300 — 10

600 дальтон, отсутствующие в РБЖ условно здоровых людей. Низкомолекуляр :,ные компоненты больных ингибируют реакции ветвления oL --глюканов. Наибольший эффект наблюдается при ис- 15

;пользовании 2,5 Я РНК в качестве катализатора этой реакции. Влияние низкомолекулярных органических соединений РБЖ на реакцию ветвления х-глюканов показано в табл. 1. 20

Пример 2. Определение биологической активности препаратов "желтого вещества" (ЖВ) природных вод. ЖВ представляет собой наиболее растворимую фракцию веществ гуминовой приро- 25 ды, составляющих значительную часть органического вещества природных вод.

В то же время концентрация ЖВ по отношению к большому количеству других растворенных соединений, например к 30 концентрации неорганических солей, черезвычайно мала, поэтому способы и тест-.системы для оценки их свойств должны обладать высокой чувствительностью. Влияние препарата ЖВ на активность реакции ветвления оС-глюканов приведено в табл. 2.

Как видно из табл. 2, проверка возможного наличия ветвящей активности в препаратах ЖВ без добавления био-gp катализаторов показала отрицательные результаты. При добавлении ЖВ в инкубационную смесь наблюдается активация реакции, наиболее эффективно проявляющаяся IIpH HCIIOJIb3OBBHHH 2,5 S РНК.

Максимальная скорость реакции наблюдалась при 10 мкг ЖВ в пробе. При использовании больших, чем 30 мкг, количеств ЖВ активирующнй эффект был вы-. ражен слабо. Таким образом, применение 2,5 S РНК позволяет не только выявить биологическую активность ЖВ, но и оценить концентрацию этого вещества в сложных многокомпонентных системах природных вод, при которых они

55 наиболее активны. Кроме того, выявление концентрационного эффекта при оценке биологической активности химических соединений дает информацию о сложности механизма действия природных физиологически активных веществ и возможной специфике их действия в естественных условиях.

Для оценки биологической активности ЖВ реки и моря данное вещество в различных концентрациях (при разведениях от 1 до 160) вносилось в известную и в предлагаемую тест-системы.

Результаты испытаний показали, что при использовании культуры клеток надежный биологический ответ, выражающийся в очаговой деструкции клеточного пласта, удается наблюдать лишь на вторые-третьи сутки при концентрации ЖВ не менее 25-30 мкг/мл, в то время как при использовании предлагаемого способа эффект удается обнаружить в течение

1 ч при концентрации ЖВ 5-7 мкг/мл.

Выявление биологической активности органических соединений с помощью предлагаемого и известного способов приведено в табл. 3.

Из приведенного примера видно,что для выявления биологического эффекта на культуре ткани требуется увеличение концентрации ЖВ в 5 раз и значительное увеличение времени анализа.

Предлагаемыи способ является простым и надежным, поскольку 2,5 PHK устойчива при длительном хранении в отличие от культуры ткани.

Применение способа испытано на различных объектах: экзометаболитах

РБЖ (выявлено наличие ингибирующего эффекта экзометаболитов РБЖ людей с наличием злокачественных новообразований); ЖВ ) (выявлена концентрационная зависимость биологической активности препаратов KB природных вод) и других физиологически активных веществ (выявлена различная степень биологической активности органических веществ, содержащихся в образцах воды кислородной зоны и SH-зоны Черного моря, а именно фракций с мол. массой (500 дальтон для кислородной зоны и фракций с мол. массой C 300000 дальтон для SH-зоны).

Формула. изобретения

Способ оценки биологической активности органических соединений в водных растворах путем введения исследуе-. мого раствора в ферментативную тестсистему с последующей регистрацией

5 1605206

6 изменений свойств системы, о т л и — честве тест»системы используют прелач а ю шийся тем, что, с целью рат 2,5 S PHK „à оценку биологической упрощения способа при одновременном активности проводят по наличию измеповышении его чувствительности, в ка- некий скорости ветвления Q -глюканов.

Добавки ффект обавки, 7О

2000-100 0

1800-200 -10

1 700-180 -15

1100-200 -45

850-100 -57,5

Таблица 2

Активность 2,5 S

РНК, ед./мг PHK

Эффект добавки, количество

Добавки

ЖВ, мкг раз

5

0

3,20

5,80.

2,00

1,35

2000-200

6400-200

11600-210

4000-100

2700-120

Таблица 3

Биологическая активность

Добавки

ЖВ, мк

С помощью культуры клеток помощью

5 S .PHK

Контроль (добавки отсутствуют)

РБЖ условно здоровых. людей

5 мкл

10 мкл

РБЖ людей с диагнозом: рак прямой кишки

5 мкл

10 мкл

Таблица 1

Активность

2,5 РНК, ед./мг

PHK