Способ определения желчных кислот в биологической жидкости
Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения желчных кислот в биологических жидкостях. Цель изобретения - повышение точности и чувствительности способа. Способ включает экстрагирование желчных кислот из биологического материала при пониженных температурах и смесью этанола с ацетоном
сОюэ сОВетских
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАР CT8 Е ННЫ и КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4411066/14 (22) 25,01.88 ° (46) 30.01.91, Бюл. hh 4 (71) Киевский государственный университет им. Т.Г. Шевченко (72) С.П. Весельский, П.С. Лященко и
И.А. Лукьяненко (53) 612.015(088.8) (56) Лаб. дело, 1979. М 3, с. 176-181. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖЕЛЧНЫХ
КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ (57) Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения желчных кислот в биологических жидкостях.
Цель изобретения — повышение точности и чувствительности способа. Способ включаИзобретение относится к биохимии и применимо для изучения обмена желчных кислот в организме животных и при физиологических исследованиях функционального состояния гепатобилиарной системы, а также может быть использовано в медицине для диагностики и контроля за ходом лечения при заболеваниях печени.
Цель изобретения — повышение точности и чувствительности способа.
Цель достигается тем, что экстрагирование желчных кислот иэ биологического материала проводят при (-10-0 С) смесью этанола с ацетоном (1:3). Последнее позволяет сохранять тауроконьюгаты и уменьшить примеси липидного характера в пробах.
Хроматографическое разделение свободных и коньюгированных желчных кислот проводят в системе, включающей амиловый
„„ 42„„1624322 А1 ет экстрагирование желчных кислот иэ биологического материала при пониженных температурах и смесью этанола с ацетоном (1:3), хроматографическое разделение в гомогенной общей системе растворителя для свободных и коньюгированных желчных кислот, состоящей иэ амилового эфира уксусной кислоты, толуола, бутанола и воды (3:1:1:3:1). Количественная денситометрическая оценка содержания желчных кислот осуществляется после окрашивания хроматограмм комплексным красителем, включающим 15 мл ледяной уксусной кислоты, 1 г фосфорномолибденовой кислоты, 1 мл концентрированной серной кислоты и 5 мл
50$-ного водного раствора трихлоруксусной кислоты. 3 табл. эфир уксусной кислоты, толуол, бутанол, уксусную кислоту и воду в соотношении (3:1:1:3:1), которая позволяет одновременно разделить свободные и коньюгированные желчные кислоты при одномерной хроматографии на стандартных пластинах
"ЯМоГ. Это сокращает время хроматографического анализа и уменьшает расход материалов и реактивов. Количественную оценку содержания каждой желчной кислоты проводят после опрыскивания хроматограмм 5 -ным раствором фосфорHoMoëèáäåíoâoé кислоты в смеси, включающей ледяную уксусную кислоту, концентрированную серную кислоту и 50 ный раствор трихлоруксусной кислоты при соотношении 15;1:5. Это позволяет проявлять при 60-70 С без изменения фона. Чувствительность метода 0,25-0,35 мкг для каждой свободной или коньюгированной желчной кислоты, что более чем в два раза
1624322
55 превышает чувствительность способа прототипа.
Способ осуществляется следующим образом.
0,1 мл желчи или 0,2 мл цельной крови человека или животного вносят в стеклянную центрифужную пробирку, в которую предварительно налито соответственно 1,9 или 1,8 мл охлажденной экстрагирующей смеси этанола с ацетоном (1:3), Дуоденальное содержимое сперва необходимо гомогенно диспергировать в дистиллированной воде (разведение в 2 раза), а затем 0,5 мл взвеси внести в пробирку, где ранее налито
4,5 мл указанной смеси органических растворителей. После тщательного перемешивания стеклянной палочкой содержимого пробирки ставят в морозильное отделение холодильника на 25 — 30 мин. Затем пробы центрифугируют 10 — 12 мин при 3000—
4000 об/мин,сливают экстракт в конусовидные стеклянные пробирки и упаривают при
37-40 С под вытяжным шкафом до сухого остатка (процесс можно ускорить с помощью вакуум-шкафа). Сухой остаток растворяют в смеси этанола с водой (6:4) в зависимости от исследуемого биологического материала в 10 — 20 мкл при анализе крови или 50-100 мкл при исследовании желчи.
Исследуемые вытяжки по 5 или 10 мкл наносят на предварительно промытые и размеченные хроматографические листы.
Хроматографическое разделение свободных и конЪюгированных желчных кислот осуществляется в системе амиловый эфир уксусной кислоты, толуол, бутанол, уксусная кислота и вода (в соотношении 3:1:1:3:1) в стеклянных прямоугольных камерах. Одномерная хроматография позволяет на хроматографической пластине 15х15 см провести
8-9 анализов.
Для количественного определения содержания отдельных желчных кислот с помощью денситометра в отраженном свете (А -620 нм) — пятикратное опрыскивание хроматограмм из мелкодисперсного стеклянного пульверизатора следующим красителем: 15 мл ледяной уксусной кислоты, 1 r фосфорномолибденовой кислоты, 1 мл серной кислоты и 5 мл 50 -ного раствора трихлоруксусной кислоты, Хроматограммы проявляли при 60-70 С в течение 5 мин, В табл. 1 представлены данные о содержании желчных кислот в желчи и крови человека, полученные при определении способом Громашевской и др, и предлагаемым способом. Иэ этих данных видно, что при определении содержания желчных кислот в желчи методом Громашевской и др.
50 количество тауроконЪюгатов уменьшено на
23,6, но в сумме возросло на 26,7)(, содержание свободных желчных кислот.
Для сравнения чувствительности и точности способа со способом-прототипом представлена табл. 2 о зависимости между количеством нанесенной на хроматограмму желчной кислоты и цифровыми показателями с интегратора денситометра GP-920 (Шимадзу, Япония), в которых одновременно учтена интенсивность поглощения света (il-620) окрашенным пятном, величина его площади и вычтено поглощение исходного фона на равной площади пятна. Данные приведены на примере холевой кислоты.
Результаты исследований по влиянию температурных режимов на экстракцию желчных кислот приведены в табл, 3, Приведенные в табл. 3 данные, в частности по суммарному содержанию желчных кислот, показывают, что предложенная смесь органических растворителей при 1020-кратном разведении исследуемой желчи практически одинаково экстрагирует желчные кислоты во всех исследуемых температурных режимах и обладает высокой депротеинизирующей способностью. Вместе с тем при экстракции в условиях физиологического и комнатного температурных режимов в экстракте желчных кислот присутствовала в значительных количествах примесь органического компонента (скорее всего липидного характера), которая на тон/ кослойных хроматограммах затрудняла прямое определение содержания гликохолевой кислоты и необходимо было прибегать к косвенным расчетам для этой кислоты. Экстрагирование охлажденной смесью органических растворителей в условиях нижнего отделения холодильника вело к снижению содержания примеси до уровня, который позволил прямо определять концентрацию гликохолевой кислоты, а при экстракции в условиях низкотемпературного морозильного отделения холодильника эта примесь практически не попадала в экстракт желчных кислот, Последние условия экстракции желчных кислот (-10 — 0 С) определены как оптимальные и легковоспроизводимые в любой лаборатории, Предлагаемый способ позволяет в сравнении с прототипом повысить более чем в два раза чувствительность (обнаруживает
0,25 — 0,35 мкг желчной кислоты на хроматограмме, в то время как в прототипе около 1 мкг исследуемых кислот); высокая чувствительность способа позволяет применить его в микроисследованиях. при этом не требуется внутривенный отбор крови, так как для
1624322 анализа необходимо не более 0,2 мл цельной крови, которую можно взять из пальца. смесью этанола с ацетоном при их объемном соотношении 1,3 при температуре -10—
0 С, концентрирование осуществляют при
37-40 С, п ри хроматографическом разделе5 нии в качестве растворителя используют систему, содержащую амиловый эфир уксусной кислоты, толуол, бутанол, уксусную кислоту и воду при их соотношении (3:1:1:3:1), а окрашивание хроматограмм
10 проводят 5;(,-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в смеси ледяной уксусной, концентрированной серной и 50ь-ной трихлоруксусной кислот, взятых в соотношении 15:1:5 (по объему).
Таблица !
Формула изобретения
Способ определения желчных кислот в биологической жидкости путем экстрагирования их иэ исследуемого материала, концентрирования и хроматографического разделения экстракта на силикагеле, окрашивания хроматограмм раствором фосфорномолибденовой кислоты с последующей денситометрией. отличающийся тем, что, с целью повышения точности и чувствительности способа, экстракцию проводят
Гликохолевая кислота
Таурохенодезоксихолевая + тауродезоксихолевая кислоты
Гликохенодезоксихолевая + гликодезоксихолевая кислоты
Холевая кислота
Хенодезоксихолевая + дезоксихолевая кислоты
Таурохолевая кислота
Способ олределвния желчных кислот г/л
А. Печеночная желчь
2,796
0,13
2.964
О,!4
0.867
0.09
0.526
0,04
1,595
0.11
1,258
0.09
1,123
0.12
1.456
0.1 !
1,372
О.!5
1,8!2
0,09
3,875
О.!8
3,937
О,!2
Прототип М
+В
0редлв- М гаемый ч.п! способ
В. ельная к еь
Прототип М чй!
Не обнаруживается
0.278
0,0!4
0.223
0.009
0.669
0.0!8
0,498
0.015
1,093
0,03!
Предлв- М гвемый йп! способ
Не обнаружвг на
8. ельная к вь, г/л
М 0.0028
0.0022
О 0067
0,0050
0.0109
Таблица 2
П ототип
П е агаемый способ
Показатели с интегратора денситомет а и-9
Кол — во холевой кислоты, мкг
Показатели с интегратора денситомет а и-11
Кол — во холевой кислои +и!
0+m ты,мкг
2,5
0,9
0.8
0.7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0.1
54657
41312
11014
5263
1824
1793
1761
1726
1671
1592
1546
1487
1473
3869
2741
1516
647
314
122
108
109
93
96
87
84
78
2,5
0,9
0,8
0.7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
4968
1736
1578
1381
1232
1028
848
698
539
376
318
2472
1411
1109
278
93
87
81
67
54
48
41
32
29
1624322
Твбвицв 3
Составитель А. Агуреев
Редактор О. Спесивых Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор И. Эрдейи
Заказ 184 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101
