Способ определения концентрации ионов кальция в растворе

 

Изобретение относится к физико-химической биологии, биохимии и биотехнологии и может быть использовано для определения концентрации ионов кальция в растворе. Цель изобретения - повышение чувствительности и селективности способа в присутствии ионов магния. Для этого в исследуемый раствор помещают чувствительный элемент в виде образца парвальбумина, иммобилизованного на коллагене, и регистрируют изменения спектра триптофановой флуоресценции парвальбумина, зависимые от концентрации свободных ионов кальция в растворе. 3 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (191 (11) (5))5 С, 01 И 33/50

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А8ТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4406 t 13/30-14 (22) 07. 04.88 (4Ь) 23.07.90. Бюл. 1."- 27 (71) Институт биологической физики

АН СССР (72) Е.А.Пермяков, В.Л.Шныров, И.В.Дятчин и Э.А.Бурштейн (53) 612.015(088.8) (56) Anal. Biochem., 1986, 157, 2, р. 345-352. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ

ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В РАСТВОРЕ (57) Изобретение относится к физикоИзобретение относится к физико-химической биологии, а именно к способам определения концентрации ионов кальция в растворе, и может быть широко использовано, например, для определения параметров свяэывания кальция биополимерами, контроля за протеканием биохимических реакций, определения кальция в тканевых жидкостях и крови (медицина), контроля за содержанием кальция в жидких пищевых продуктах (пищевая промышленность).

Целью изобретения является повышение,чувствительности способа, а также селективности при исследовании растворов в присутствии ионов магния.

Цель достигается тем, что согласно способу определения концентрации ионов кальция в растворе, включающему помещение чувствительного элемента в исследуемый .раствор и регистрацию возникающих в нем изменений, в ка2 химической биологии, биохимии и биотехнологии и может быть использовано для определения концентрации ионов кальция в растворе. Цель изобретения— повышение чувствительности и селективности способа в присутствии ионов магния. Для этого в исследуемый раствор помещают чувствительный элемент в виде образца парвальбумина, иммобилизованного на коллагене, и регистрируют изменения спектра триптофановой флуоресценции парвальбумина, зависимые от концентрации свободных ионов кальция в растворе. 3 ил. честве чувствительного элемента используют парвальбумин, иммобилиэованный на коллагене и регистрируют изменение спектра триптофановой флуоресценции парвальбумина.

На фиг. 1 представлена зависимость положения максимума спектра флуоресценции парвальбумина в чувствительном элементе от концентрации ионов кальция и длительности обработки его глутаровьм альдегидом; на фиг. 2 нормированная на максимальное изменение зависимость положения максимума спектра флуоресценции иммобилизованного на коллагене парвальбумина от 4логарифма концентрации свободного Са в растворе при различных рН; на фиг.3 — нормированные по максимальному изменению зависимости положения максимума спектра флуоресценции иммобилизованного парвальбумина от логарифма концентрации свободного кальция

158025 6 в растворе, измеренные в присутствии различных концентраций ионов Ng

2+

Пример 1. На кварцевую пластину размером 8х20 мм толщиной 1,5 мм наносят 1 мг лиофилизованного .кисло. торастворимого коллагена и раство,ряют его в 100 мкл 0,05 М уксусной кислоты, а затем добавляют 0 5 мг лио-. филизованного парвальбумина, размешивая смесь до полного растворения. и распределяя ее по поверхности пластинки в виде пятна (диаметром 5 мм) . После этого смесь высушивают на возду хе, а затем. вымачивают в растворе

50 мМ трис-НС1, рН 7,0-7,5, подсушивают на воздухе до испарения капель и выдерживают некоторое время над парами глютарового альдегида в замкнутом объеме. После этого чувствитель- 20 ный элемент вымачивают в 50 MN трисНС1, рН 7,0-7,5, в течение 20 мин и высушивают на воздухе. Полученная таким способом пленка прочно удерживается на кварцевой пластинке, позволяя воспроизводимо проводить измерения (более 5000 циклов собственно измерений с последующей отмывкой чувствительного элемента) в течение 6 мес. Достоинством предлагаемого способа является отсутствие высоких требований к равномерности чувствительной пленки, небольшое (менее 1 мг) количество белка на один чувствительный элемент и высокая (за счет иммобилизации) его механическая прочность.

Для получения калибровочной кривой чувствительный элемент на кварцевой пластинке помещают в измеритель- 40 ную кювету с кальций"ЭГТЛ буфером, задавая различную концентрацию свободного кальция. С помощью спектрофлюориметра измеряют положение максимума спектра триптофановой флюоресценции иммобилизованного парвальбумина, строя калибровочную кривую— зависимость положения максимума спектра флюоресценции от десятичного логарифма концентрации свободного кальция (фиг. 1, кривая 1). После калибровки чувствительный элемент помещают в буферный раствор 10 мМ трис-НС1, рН 7,0, приготовленный на дистиллированной воде, и измеряют максимум спектра его триптофановой флюоресценции, который в данном случае был на 33510,5 нм, По калибровочной кривой это соответствует десятичному логарифму концентрации свободного кальция (-5,2Ы), 1), что хорошо согласуется с величиной, полученной из измерений методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии (-5,3). Из приведенного видно, что использование предлагаемого способа позволяет при малом количестве парвальбумина, используемого на изготовление чувствительного элемента, при простоте изготовления и низких требованиях к равномерности распределения белка по поверхности кварцевой подложки обеспечить очень высокую точность опредения ионов кальция.

Как видно из фиг. 1, предлагаемый способ позволяет определять концентрацию свободного кальция в растворе

=В в диапазоне 10 -10 моль/л не хуже, чем у прототипа, причем, как видно иэ фиг. 2, эта чувствительность практически не изменяется в диапазоне рН 6,7 — 7,5. Кроме этого, как видно из фиг. 1, время выдерживания в парах глутарового альдегида (от которого зависит степень поперечного сшивания белков) является удобным параметром для регулировки чувствительности (на; клон градуировочной кривой) датчика в узких диапазонах концентрации ионов кальция.

Полученные коэффициенты селективности предлагаемого устройства к ионам магния значительно ниже таковых для известных ионселективных электродов. При концентрациях свободного кальция в растворе от 10 до

10 моль/л величина коэффициента селективности к магнию лежит в диапазоне от 2 10 до 2 10 при измене-Б нии концентрации магния от 10 до

10 моль/л. При концентрации кальция выше 10 моль/л коэффициент селективности к магнию становится меньше 10

В условиях определения селективнос" ти, приведенных в описании прототипа (1 мМ Np ), коэффициент селективносг ти предлагаемого способа составляет

0,9 10 7 (для прототипа 3,6 10 ).

Коэффициенты селективности к ионам натрия и калия в присутствии 100 мМ

-т

Na и К составляют 2 10 (5,3 10 ) и 2 10 (2,1 ° 10 ) соответственно (в скобках данные для прототипа).

Пример 2. Определение концентрации кальция в плазме крови собаки.

5 158

Приготовленный, как описано в примере 1, чувствительный элемент, представляЮщий собой пленку коллагена с иммобилизованным парвальбумином, нанесенную на кварцевую пластинку, предварительно освобожденный от Са г+ с помощью раствора 10 М ЭГТА (рН 8) и отмытый от ЭГТА в деионизованной воде, помещают в разбавленный в

10 раз раствор плазмы крови собаки., Через несколько минут пластинку с чувствительным элементом вынимают из раствора, капли раствора на ней удаляют встряхиванием и с помощью фильтровальной бумаги, а затем помещают ее в кюветное отделение спектрофлуориметра, приспособленного для регистрации излучения с передней поверхности образца, и измеряют спектр триптофановой флуоресценции парвальбумина.

По положению спектра флуоресценции, пользуясь заранее полученной калибровочной кривой чувствительного элемента, определяют концентрацию свободного кальция в растворе, которая оказалась равной 2,2 мМ. Это хорошо согласуется с данными, полученными на

ЛЩр

НМ

0256 6 том же растворе с помощью коммерческих кальцийселективных электродов фирмы "Orion" (1,7 мИ) и фирмы "Ra5

Формула изобретения

Способ определения концентрации ионов кальция в растворе путем помещения ионоселективного элемента в исследуемый раствор с последующей регистрацией изменения физического по, казателя в нем, о т л и ч а ю щ и йf5 с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, а также селективноети при исследовании растворов в присутствии ионов магния, в качестве ионселективного элемента используют парвальбумин, иммобилизованный на коллагене, путем смешивания парвальбумина с коллагеном, формирования пленки и обработки ее парами глутарового альдегида в течение 530 мин, а в качестве физического показателя регистрируют изменения спектра триптофановой флуоресценции парвальбумина.

15Ы 0256

-g -7

700

Редактор С.Пекарь

Заказ 2008 Тираж 512 Подписное

ВНИипи Государственного комитета по изобретениям и открьггиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издателЬский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 лн

1Я

-9 -7 -5 -3

1уЕса

Фигз

Составитель А.Агуреев

Техред Л;Сердюкова Корректор А.Осауленко