Способ оценки повреждений генома ооцитов лабораторных животных

 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и биологии и может быть использовано в медицинской генетике для изучения действия разнообразных повреждающих факторов на созревающие ооциты. Цель изобретения состоит в снижении трудоемкости способа. Способ оценки повреждений генома ооцитов лабораторных животных включает определение момента начала естественной овуляции животных, осуществление неблагоприятного воздействия в преовуляторном периоде и опосредованную оценку состояния ооцитов путем определения уровня микроядер в клетках кумулюса. Способ позволяет оперативно оценить влияние вредных факторов среды на репродуктивные функции животных при ограниченном количестве используемых лабораторных животных. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СО@ЕЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU, 1630792 А 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К A BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ венной овуляции по времени появления проовулировавших ооцитов в ампуле яйцеводов.

Весь преовуляторный период разбивался по стадиям мейоза, и воздействия производились на стадии проэструс. Использовались следующие типы неблагоприятных (повреждающих) воздействий.

Алкогольная интоксикация. Алкоголь вводился однократно, внутрижелудочно в дозе

9 г/кг веса 40% его раствора (из расчета

3,6 г/кг 100%-ного раствора).

Стрессирующее воздействия. Производилось путем обездвиживания животных, закрепляя их на спине на доске. Самок подвергали иммобилизации в течение ч.

Воздействие мутагеном. Мутаген прямого действия — уретан вводился внутрибрюшинно из расчета 1 г на кг веса животного (1 г/кг).

Воздействие мутагеном (гербнцид 2,4 ——

Д-дихлорфеноксиуксусная кислота). Вводился одноразово внутрижелудочно в дозе

10 мг/кг.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

flQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4658142/15 (22) 01.03.89 (46) 28.02.91. Бюл. № 8 (71) Институт акушерства и гинекологии (72) Н. М. Слозина и О. Ю. Ливотова (53) 591.465.12 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 1498464, 30.05.88. (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ПОВРЕЖДЕНИЙ

ГЕ НОМА ООЦИТОВ ЛАБОРАТОР НЫХ

ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к экспериментальной медицине и биологии и может быть использовано в медицинской генетике для изучения действия разнообразных поврежИзобретение относится к экспериментальной медицине и биологии и может быть использовано в медицинской генетике для изучения механизмов повреждения созревающих ооцитов при различных неблагоприятных воздействиях, таких как воздействие химическими мутагенами, алкогольная интоксикация, радиоактивное облучение, стресс и другие.

Цель изобретения — снижение трудоемкости способа.

Пример. Работа выполнялась на самках крыс линии Вистар весом 160 — 200 г, полученных из питом ника лабораторных животных АМН СССР «Рапполово», Животные в течение 3 — 4 недель содержались в стандартных условиях вивария на обычном брикетном питании с добавлением овощей и творога при дозированном освещении (12:12). После 3-недельной адаптации к световому режиму путем исследования вагинальных мазков выявлены животные с нормальным 4-дневным эстральным циклом и определены у них времена. естест2 дающих факторов на созревающие ооциты.

Цель изобретения состоит в снижении трудоемкости способа. Способ оценки повреждений генома ооцитов лабораторных животных включает определение момента начала естественной овуляции животных, осуществление неблагоприятного воздействия в преовуляторном периоде и опосредованную оценку состояния ооцитов путем определения уровня микроядер в клетках кумулюса.

Способ позволяет оперативно оценить влияние вредных факторов среды на репродуктивные функции животных при ограниченном количестве используемых лабораторных животных. 1 табл.

1630792

Формула изобретения

Воздействия

Количество

Ооцитов

Частота клеток

ДОСТОвеРДостоверность

ОтЛИЧИй От

Смертность эмбрионов при воздействиях, 7 кумулюса с мик роядрами (на 1000 клеток) ность отли

Чий ОТ КОНТ контроля роля

25,5

25,2

Не изучали

43,9

9,5

39

39

8

12

17

О, 001

0,001

0,001

0,01

АЛКОГОЛЬ

Стресс

Уретан

2,4-Д

Контроль

О, 001

0,001

Не изучали

0,001

Животных забивали после наркоза путем декапитации не позднее 5 ч от начала овуляции. Из ампулы яйцеводов извлекали проовулировавшие ооциты, которые к этому времени находились на стадии метафазы 11.

Ооциты с клетками кумулюса помещали в лунку со средой (среда 199, температура

37 С), добавляли кристаллы гиалуронидазы для отделения ооцитов от клеток кумулюса. Клетки кумулюса помещали в маленькую пластиковую пробирку со средой 199 и несколькими каплями женской сыворотки для инактивации фермента. Кумулюс далее центрифугировали в течение 5 мин (1000 об/

/мин), сливали надосадочную жидкость и добавляли порцию охлажденного фиксатора (+4 С, 1 ч ледяной уксусной кислоты на

3 ч метилового спирта). Осадок ресуспензировали и снова центрифугировали в течение 5 мин. Сливали надосадочную жидкость и приливали вторую порцию фиксатора, размешивали, центрифугировали в течение 5 мин. Затем кумулюс в небольшой порции фиксатора наносили каплями микропипеткой на предметное стекло. Стекло подсушивали на спиртовке, клетку кумулюса окрашивали красителем Романовского-Гимза.

Анализ клеток кумулюса проводился под микроскопом при увеличении иммерсионного объектива 90 .

Частоту встречаемости микроядер в препарате определяли на 1000 просмотренных клетках кумулюса.

Полученные результаты отображены в таблице. В таблице приведены также данные о смертности эмбрионов при исследованных неблагоприятных воздействиях и данные по контрольной группе животных, не подвергавшихся неблагоприятным воздействиям (контроль).

Из таблицы следует, что воздействие неблагоприятных факторов в преовуляторном периоде приводит к гибели эмбрионов.

При этом в клетках кумулюса увеличивается число микроядер. Таким образом, частота микроядер в клетках кумулюса является показателем повреждающего действия факторов на геном ооцита, вследствие повреждения которого эмбрион теряет способности к нормальному развитию и гибнет.

Выполненные исследования наглядно свидетельствуют о том, что оценка повреждений генома ооцитов лабораторных животных при различных неблагоприятных воздействиях может быть быстро и эффективно проведена путем определения уровня микроядер в клетках кумулюса.

Трудоемкость предлагаемого способа по сравнению с известными резко снижается за счет того, что исключены продолжительные операции поклеточного фиксирования ооцитов. Поскольку каждый ооцит окружен большим количеством клеток кумулюса, то более чем на два порядка возросло количество клеточного материала для цитогенетического анализа, получаемого от одного животного. Это позволяет использовать предлагаемый способ для широкомасштабных исследований с ограниченным количеством животных, а также применять его в качестве оперативного метода оценки влияния на репродуктивные функции лабораторных животных вредных факторов среды.

При реализации предлагаемого способа сами ооциты сохраняются и могут быть использованы для дальнейших исследований по известным методикам.

Экономический эффект от использования предлагаемого способа достигается за счет того, что сокращается продолжительность экспериментальных исследований и уменьшается число лаборантов. В частности применение предлагаемого способа вместо известного способа (базовый вариант) для оценки повреждений генома ооцитов при действии одного неблагоприятного фактора позволяет снизить число лаборантов от 3 до 1.

Способ оценки повреждений генома ооцитов лабораторных животных, включающий определение момента начала естественной овуляции у животных, осуществление неблагоприятного воздействия на них в преовуляторном периоде, декапитацию животных, извлечение ооцитов и оценку состояния генома ооцитов, отличающийся тем, что, с целью снижения трудоемкости способа, состояние генома ооцитов оценивают по уровню микроядер в клетках кумулюса.