Способ определения иммунореактивности животных
Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и биохимии, в частности к разработке способа определения иммунореактивности организма. Целью изобретения является повышение чувствительности способа . Для этого в качества испытуемого материала используют суспензию лейкоцитов и лимфоцитов крови, на поверхности которых проводят определение свободных легко реагирующих сульфгидрильных групп и дополнительно вяло реагирующих экранированных SH-групп путем добавления к титруемой суспензии клеток мочевины в концентрации до 1,5-2,0 н. раствора, с последующей регистрацией величины падения силы тока. При этом у животных с высокой иммунореактивностью содержание SH-групп составляет 19,8 ±0,5 10 моль/клетка, а у животных с иммунодефицитными состояними - 10 1015 - 2,5 моль/клетка. 5 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я)5 G О1 N 33/50
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4655354/13 (22) 27,02.89 (46) 28,02.91. Бюл. N 8 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им,Я.Р,Коленко (72) В.С.Гевондян, В.П.Шишков и И.B.Коропов (53) 612.017.1(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР
N 1101739, кл, G 01 N 33/50, 1984, - Граевский Э.Я, Сульфгидрильные группы и радиочувствительность, М.: Атомиздэт, 1969, с.130. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОРЕАКТИВНОСТИ ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и биохимии, в частности к разработке способа определения иммунореакИзобретение относится к ветеринарной иммунологии и биохимии, в частности, к разработке способа опаределения иммунореактивности организма.
Цель изобретения — повышение чувствител ьтности способа.
Для этого используя в качества материала суспенэию лейкоцитов и лимфоцитов крови, определяют вяло реагирующи, экранизованные SH-группы на их поверхности путем добавления к титруемой суспенэии клеток в качестве детергента мочевины в конечной концентрации до 1;5-2,0 N раствора, с последующей регистрацией величины падения силы тока, пропорциональной количеству высвобождающихся вяло реагирующих SH-групп. а учет результатов проводят по сумме легко и вяло реагирую„„5U 1631428 А1 тивности организма. Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Для этого в качества испытуемого материала используют суспензию лейкоцитов и лимфоцитов крови, на поверхности которых проводят определение свободных легко реагирующих сульфгидрильных групп и до полнительно вяло реагирующих экранированных SH-групп путем добавления к титруемой суспензии клеток мочевины в концентрации до 1,5 — 2,0 н. раствора, с последующей регистрацией величины падения силы тока. При этом у животных с высокой иммунореактивностью содержание SH-групп составляет
19,8 + 0,5 10 моль/клетка, а у животных с иммунодефицитными состояними — 10
10 15 — 2,5 10 моль/клетка, 5 табл. щих SH-групп моль/клетка, при этом у здовых животных с высокой иммунореактивно- О стью содержание всех SH-групп составляет ()
19,8 0,5 10 моль/клетка, а у животных с иммунодефицитнымисостояниями 10 10 р г — 2,5 10 моль/клетка.
-15
Пример 1. В пробирку, содержащую раствор ЭДТА отбирают кровь из вены жи- 1 О вотного, затем к 1,0 мл крови доСавляют дистилированную воду (или гемолитическу>о смесь с сапонином) в отношении 1:20, пере- а мешивают в течение 15 с и немедленно прибавляют 10-кратный раствор Хенкса для восстановления осмотического давления.
Клетки осаждают центрифугированием при
400 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают и вновь прибавляют сначала дистидированную воду, а затем спустя 15 с
1631428 раствор Хенкса и повторно осаждают центрифугированием. К осадку добавляют 15 мл аммиачно-нитратного 0,1 N буфера с рН 6,8.
Лимфоциты иэ крови выделяют методом дифференциального центрифугирования в
17 -ном растворе верографина, Полученные суспензии клеток помещают в стаканчик объемом 30 мл и добавляют аммиачно-нитратный буфер (рН 6,8, 0,1 N) до обьема 25 мл, В раствор погружают электроды и определяют величину исходного тока по гальванометру. Титрацию ведут раствором 0,5 10 M нитрата серебра по
50 мкл (0,05 мл). Способ определения SHгрупп на поверхности клеток основан на том, что порции азотно-кислого серебра, реагирующие со свободными легко доступными SH-группами, связываются не вызывая при этом появления тока, Однако, как только все доступные SH-группы будут блокированы, в растворе появляются свободные ионы серебра, которые восстанавливаются на платиновом электроде, что вызывает появление диффузионного тока. Сила тока пропорциональна концентрации ионов металла в растворе. Откладывая на графике силу тока против количества добавленного реагента, определяют конечную точку титрования (точку эквивалентности), Количество пошедшего раствора серебра в молях делят на число клеток в суспензии, определяя тем самым среднее содержание свободных легко реагирующих SH-групп на одну клетку, моль/клетка. Определение числа клеток проводят либо на целоскопе, либо в камере Горяева.
Затем для определения числа вяло реагирующих свободных SH-групп на поверхности лейкоцитов и лимфоцитов к титруемой пробе добавляют мочевину до конечной концентрации ее 2 N, при этом происходит разрыхление структур мембранных белков и высвобождение ранее экранированных малодоступных SH-групп, которые быстро связываются с избытком ионов серебра, находящихся в растворе, в результате чего сила тока падает пропорционально.количеству высвобождающихся вяло реагирующих SH-групп. По величине снижения тока рассчитывают количество азотно-кислого серебра в молях. Эту величину делят на число клеток, определяя содержание SH-групп в молях на одну клетку.
Общее количество всех свободных SHгрупп в мембране равно сумме легко и вяло реагирующих SH-групп.
Так на титрацию суспензии лейкоцитов кролика, соцержащую 7 10 клеток, идет
0,12 5 10 моль А9МОз.
Количество легко реагирующих SH-групп — 7
0,12,э 10 — 0 08 101з = 8 . 10 15
7 . 10 моль/клетка.
При добавлении к титруемой смеси 3 г сухой мочевины (2 N раствор) происходит в течение 5 мин снижение силы тока на 3 мА по гальвонометру. Такое снижение обуславливает связывание 0,15 0,5 10 раствора азотно-кислого серебра, Содержание
015 50 10 вяло реагирующих SH-групп
7 10
= 10,0 10 моль/клетка.
Общее содержание всех свободных $Нгрупп на поверхности клеток равно сумме легко и вяло реагирующих S H-групп.
8 10 + 10 10 = 18 10 моль/клетка.
Способ апробируют с положительным результатом на животных инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) результаты которых приведены в таблицах, Из табл.1 видно, что у неинфицированных (здоровых) кроликов на поверхности одного лейкоцита содержится значительное количество свободных S H-групп (19,8 ++
+ 0 10 моль/клетка), из которых 9,8
10 моль/клетка приходится на легко реагирующие и 10,7 10 на вяло реагирую-15 щие SH-группы.
У животных инфицированных ВЛ KPC отмечается резкое снижение SH-групп на поверхности лейкоцитов в 2 — 3 раза, Это снижение происходит как за счет легко реагирующих, так и вяло реагирующих SHгрупп, У 82 от числа инфицированных ВЛ
КРС кроликов содержание легко реагирую40 щих $Н-групп снижается в 2 — 8 раэ в сравнении с неинфицированными. У 43 содержание вяло реагирующих SH-групп снижается в 2,5 — 10 раз и только у 8,6 количество вяло реагирующих SH-групп наблюдается в пределах нормы. Таким образом определение легко и вяло реагирующих $Н-групп свидетельствует о резком снижении экспрессии SH-групп в мембранных белках на поверхности лейкоцитов и лимфоцитов у животных инфицированных
ВЛ КРС, Исследования показывают (табл.2), что у одного и того же здорового кролика на протяжении около месячного наблюдения содержание легко и всех свободных SHгрупп является величиной стабильной и колеблется по отношению. к средней на
10 — 12 . Менее стабильным является содержание-вяло реагирующих S H-групп, количе1631428 ство их колеблется по отношению к средней на 32 . У инфицированных ВЛ КРС кроликов на всем протяжении наблюдения содержание SH-групп на поверхности лейкоцитов резко снижается, носит стабильный харак- 5 тер, Колебания уровня как легко реагирующих, так и всех SH-групп вокруг средней составляет 40 — 53, а вяло реагирующих
SH-групп — 75 . Эти исследования свидетельствуют о том, что у животных, инфици- 10 рованных ВЛ KPC происходят глубокие и стойкие изменения мембран лейкоцитов, что ведет к снижению силы иммунного ответа на тимусзависимые и тимуснезависимые антигены. 15
Из табл,З видно, что у инфицированных
ВЛ КРС кроликов отмечается выраженное снижение легко реагирующих SH-групп в иммуноглобулинах класса G в 2,5 раза и одновременно снижение титров нормаль- 20 ных антител 6 класса в 6 раз. Между снижением SH-групп в иммуноглобулинах, уменьшением SH-групп на поверхности лейкоцитов и снижением титров нормальных антител отмечается сильная кореляци- 25 онная связь. На основании изменения как лейкоцитов и лимфоцитов, так и иммуноглобулинов видно, что при инфицировании ВЛ
КРС снижение иммунореактивности обусловлено как снижением клеточного,-так и 30 гуморального иммунитета.
В табл,4 приведены данные, свидетельствующие, что в ответ на введение экзогенных липидных перекисей, полученных из льняного масла, в организме кроликов происходит 5 резкое усиление интенсивности свободнорадикальных процессов в липидах с резким повышением в крови и тканях продуктов перекисного окисления липидов. При этом, как видно из табл.4 происходят существен- 40 ные изменения содержания легко и вяло реагирующих SH-групп как на поверхности лейкоцитов и лимфоцитов, так и в иммуноглобулинах класса G. Оказывается, что наиболее уязвивым по отношению продуктов 45 перекисного окисления липидов является гуморальный иммунитет. Об этом саидетельствуют снижение SH-групп в иммуноглобулинах уже через 24 ч, падение титров нормальных антител через 48 ч, тогда как изменения со стороны SH-групп на поверхности лейкоцитов наступают намного позже (8 сут), Усиление процессов ПОЛ в организме таким образом ведет к резкому снижению иммунореактивности. С помощью определения SM-групп в иммуноглобулинах и на поверхности лейкоцитов можно выявить степень поражения при этом клеточного и гуморального иммунитета.
В табл.5 представлены данные по динамике содержания SH-групп на поверхности лейкоцитов у кроликов инфицированных ВЛ
КРС с выраженными явлениями иммунодефицита после введения в качестве иммунокорректора вакцины из коринебактерий
К Г-2 б, Из табл.5 видно, что уже через сутки после введения вакцины резко возрастает содержание SH-групп на поверхности лейкоцитов в 2,5-3 раза (на 3 сут в 4 раза). У животных неинфицированных с нормальной иммунореактивностью увеличения SHгрупп на поверхности лейкоцитов практически не ото,ечается.
Формула изобретения
Способ определения иммунореактивности животных, включающий определение легко реагирующих SH-групп в суспензии клеток путем проведения амперометрического титрования раствором азотнокислого серебра, последующим учетом результатов, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, из клеток используют лейкоциты и лимфоциты, дополнительно проводят определение вяло реагирующих экранированных SH-групп путем добавления к суспензии клеток мочевины до конечной концентрации 1,5 — 2,0 N, учет результатов проводят по сумме легко и вяло реагирующих SH-групп, при этом при значении 19,8 0,5 10 " моль/клетка животных считают с высокой иммунореактивностью, а при 2,5 10,0 10 моль/клетка — с иммунодефицитным состоянием.
1631428
Таблица 1
Содержание свободных сульфгидрильных групп на поверхности лейкоцитов у здоровых и инфицированных ВЛ КРС кроликов, моль/клетка
Свобо ные
hh hh пlп етка х 10
Легко реагирующие Вяло еаги ие С мма, все SH-r ппы
3 о овые 19,8 «- 1,01
14,0 ... 29,0
7б ... 16,8
Ин ици ованные ВЛ KPC
6,06 10"
1,25 ... 11,5
9,65 «-6 10
2,5 ... 12,8
< 0,001
< 0,01
2
4
6
8
11
12
13
14
16
17
18
19
Среднее
П е елы колебаний
2
4
6
8
11
12
13
14
16
17
18
19
21
22
Среднее
Пределы колебаний
14,5
12,9
16,1
10,1
8,5
54
7,3
6,4
6,9
7.3
8,3
8,3
8,5
8,1
6,7
12,1
13,9
1 1,2
12,1
11,3
979+5 10
5,4 ... 14,5
8,0
1,26
4,0
3,3
4,8
4,0
1,3
5.0
2,9
2,8
2,0
4,7
3,8
1,8
3,8
4,0
1,3
3,9
3,7
3,9
5,8
3,0
3,61+4 10
1,26 ... 8,05 < 0,001
10,8
9,6
12,9
7,6
1 1,2
1 1,4
11,6
8,3
8,6
6,7
8,3
15,8
8,6
10.5
16,8
12,0
9,4
11,0
8,5
15,3
1075 «-058 10 "
4,0
1,25
5,4
6,6
6,0
6,0
1 1,5
7,6
6,3
6,7
5,6
7,1
4,4
3,6
5,5
6,0
11.5
5,5
3,4
7,7
4,7
6,0
25,3
29,0
17,7
19,7
16,8
18,9
14,8
15,5
14,0
16,7
24,0
17,0
18,6
23,5
24,1
23,3
22,2
20,6
26,6
12,0
2.5
9,4
9,9
10,8
10,0
12,8
12,6
9,2
9,6
7,6
11,8
8,2
5,4
9,3
10,0
12.8
9,4
7,1
11,6
10,5
9,0
1631428
Таблица 2
Динамика содержания легко и вяло реагирующих SH-групп на поверхности лейкоцитов у одного и того же животного на протяжении 3-месячного наблюдения у здоровых и инфицированных ВЛ KPC кроликов
Таблица 3
Взаимосвязь между содержанием SH-групп на поверхности лейкоцитов, количеством SH-групп в иммуноглобулинах класса G и титрами нормальных антител в сыворотке крови у неинфицированных и инфицированных
ВЛ КРС кроликов
Неин ици ованные
Инфицированные
Показатели
Таблица 4
Динамика содержания SH-групп на поверхности лейкоцитов, в иммуноглобулинах класса G и титров нормальных антител у здоровых кроликов после введения им в/M продуктов перекисного окисления льняного масла
Свободно легко реагирующие SH-группы на лейкоцитах, моль/клетка
Свободные легко реагирующие SH-группы в иммуноглобулинах G класса, моль/моль
Вяло реагирующие SH-группы в иммуноглобулинах G класса моль/моль
Сумма всех SW-групп в иммуноглобулинах G класса
979 05 10 п =20
0,825+ 0,03. п=12
0,633 + 0,05 и =12
1,470 +. 0,06 п =12
3,61 + 0,4 10 и =22
0,375 ": 0,02 п =22
0,628 ": О,M и =22
0,997 ": 0,02 и =22
1631428
Продолжение табл. 4
Вяло реагир, SHгруппы на лейкоцитах
Легко реагир. SHгруппы в иммуноглобулинах G моль/моль
Все свободные SHгруппы, на лейкоцитах, моль/клетка
Легко реагир.
SH-группы на лейкоцитах Вяло реагир, S H-группы на лейкоцитах
Легко реагир.
SH-группы в иммуноглобунах G, моль/моль
Титры антител
Титры нормальных антител В РАГА
Все свободные
SH-группы на лейкоцитах, моль/клетка
Легко реагирующие
SH-группы на лейкоцитах
Вяло реагир.
SH-группы на лейкоцитах
Легко реагир.
SH-группы на иммуноглобулинах класса G моль/моль
10,3
3,3
10,3
11,0
21,2
27,6
0,69
0,96
0,54
0,79
0,54
0,28
14,0
20,5
20,5
16,9
22,0
18,5
8,0
12,9
10,5
12,1
5,3
6,0
9,6
5,9
10,0
4,8
16,0
13,2
0,43
0,58
0,49
0,72
0,43
0,36
1:64
1:64
1:32
1:16
1 . 4
1, 16
29
15,7
20
5,8
19,3
16,1
10,9
13,8
12,7
9,6
3,0
12,9
10,3
9,07
14,5
0,60
0,64
0,42
0,38
0,27
0,29
Таблица 5
Динамика содержания свободных легко и вяло реагирующих SH-групп на поверхности лейкоцитов и лимфоцитов кроликов инфицированных ВЛ КРС после однократного введения 2 млрд. взвеси убитых коринебактерий (приведена аналогичная динамика у здоровых кроликов)
