Способ выделения ферментных препаратов аминоацилазы, амилазы и протеаз из aspergillus oryzae

 

Изобретение относится к технической микробиологии, касается получения ферментных препаратов из амилоризина ПХ и может быть использовано в медицинской, химической, пищевой отраслях промышленности, сельском хозяйстве. Целью изобретения является упрощение процесса с одновременным повышением активностей ферментных препаратов . В качестве исходного сырья испопьэуют Амилоризин ПХ или поверхностную культуру его продуцента, а фракционирование водных экстрактов осуществляют спиртами или сульфатом аммония. Интервалы процентного содержания спиртов, при которых выпадают в осадок ферментные препараты: 35- 45% для выделения протеазы, 45-50% для выделения аминоацилазы и 72-75% для выделения амилазы. Для осаждения этих ферментных препаратов сульфатом аммония требуется соответственно 50, 60 и 80% насыщения. (Л аъ ел -U оо со ел

СОЮЗ ССВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (31) (51)5 С 12 И 9 ). ) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPbfTHSIM

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4315 701/13 (22) 12.10 ° 8 7 (46) 07.()6.91. Бюл. (21 (71) Армянский филиал Всесоюзного научно-исследовательского института химических реактивов, особо чистых химических веществ и реактивов для хроматографии и Всесоюзный научноисследовательский институт генетики и селекции промышленных ьыкроорганизмов (72) М.M.Амирханян, В.М.Степанов, О.M.Амирханян, М.Ф.Еланян, А.О.Степанян, К.А.Субботин и А.М.Миневич (53) 577.15(088.8) (56) Степанов В.M. и др. Выделение и характеристика ацилаэ g-аминокислот иэ Aspergillus oryzae. Биохимия, 1983, т. 48, 370-379.

Авторское свидетельство СССР

Ф 1265216, кл. С 12 N 9/J(), 1984. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРМБНТНЫХ ПРБПАРАТОВ АМИНОАЦИЛАЗЫ, АМИЛАЗЫ И ПРОТЕАЗ ИЗ ASPERGILLUS ORYZAE

Изобретение относится к технической микробиологии, касается получения ферментных препаратов иэ Амилориэина

ПХ и может бить использовано в медицинской, химической, пищевой промышленностях, в сельском хозяйстве, в медицине.

Целью изобретения является упрощение процесса с одновременным повышением активностей ферментных препаратов. (57) Изобретение относится к технической микробиологии, касается получения ферментных препаратов из амилоризина ПХ и может быть использовано в медицинской, химической, пищевой отраслях промышленности, сельском хозяйстве. Целью изобретения является упрощение процесса с одновременным повышением активностей ферментных препаратов . В качестве исходного сырья используют Амилориэин ПХ или поверхностную культуру его продуцента, а фракционирование водных экстрактов осуществляют спиртами или сульфатом аммонил. Интервалы процентного содержания спиртов, при которых выпадают в осадок ферментные препараты: 35457 для вь(деления протеаэы, 45-50Х для выделения аминоацилаэы и 72-757 для выделения амилаэы. Для осажпения этих ферментных препаратов сульфатом а мония требуется соответственно 50, 60 и S()i. насьп(ения.

Изобретение заключается в том, что в качестве исходного сырья используют Амилоризин ПХ или поверхностную культуру его продуцента, а фракционирование водных экстрактов осуществляют спиртами или сульфатом аммония.

Интервалы процентного содержания спиртов„при которых выпадают в осадок ферментные препараты: 35-4ОХ для выделения протеаэы, 45-50Х для выделе т ния аминоацилаэы и 72-75Х для выделе1654335 ния амилаэы. Для осаждения этих фер.ментньм препаратов сульфатом аммония

-требуются соответственно 50Х, 60 . и 80 . насыщения.

Пример 1. Ферментные препараты выделяют из высушенной культуральной массы А.отуаае, наделенной следующими активностями, ед. /г: амилолитическая 160; протеолитическая 2,3; аминоацилазная 40 ед/г. Этот препарат выпускается под названием Амилориэин ПХ.

В литровую трехгорлую круглодонную колбу, снабженную мешалкой, термомет- 15 ром и капелькой воронкой, помещают

30 г Амилориэина ПХ, добавляют 200 мп о дистиллированной воды и при 25 С, рН

7,0 и перемешивании осуществляют экстракцию в течение 2 ч. Значение рН поддерживают. добавлением 2 н . водного раствора гидроокиси натрия. Затем фильтруют на воронке Бюхнера. Осадок выбрасывают, а фильтрат, содержащий ферменты, центрифугируют на центрифу- 25 ге при 2 С и 4000 об/мин в течение

20 мин.

Супернатант переносят в колбу, охлаждают до 0-1 С и при перемешивании добавляют этанол до получения 40 30 содержания последнего. Выпавший осадок, представляющий собой препарат протеазы, отделяют центрифугированием в вышеуказанных условиях, растворяют в минимальном объеме воды и сушат лиофильно. Выход препарата по активности

ЗЗХ, активность 26 ед/г.

Супернатант переносят в колбу и в описанных условиях добавляют этанол до получения 50 содержания спирта. 40

Выпавший осадок, представляющий собой препарат аминоацилаэы, отделяют и сушат, как описано выше. Выход продукта по активности составляет 78 .

Аминоацилаэная активность равна

720 ед/г.

Супернатант после выделения hepментных препаратов протеаэы и аминоацилаэы переносят в колбу и в описанных условиях добавляют этанол до 75Х содержания последнего. Выпавший осадок -амилолитический препарат отделяют и сушат, как описано выше. Выход препарата по активности 76Х. Амилолитическая активность равна 4000 ед/г.

Супернатант, представляющий собой

75Х-ный раствор этанола, содержащий низкомолекулярные белки, пептиды и аминокислоты, подвергают перегонке в вакууме при 50-60ОС досуха. Этанол используют повторно для той же цели.

Осадок, содержащий 53 . аминокислот, в том числе незаменимые аминокислоты, валин, триптофан, лейцин, фенилала» нин, используют для получения балансированных кормов.

Пример 2. Процесс проводят аналогично примеру 1 с той разницей, что в качестве осадителя используют изопропиловый спирт, конечные концентрации которого соответственно равны: 35Х при выделении протеазы, 45 . аминоацилазы и 75 . — амилазы.

Активности ферментных препаратов протеаэы, аминоацилаэы и амилазы составляют 20, 2?О, 1650 ед/г, а выход

26, 53 и 59 . соответственно, Пример 3. Процесс проводят аналогично примеру 1 с той разницей, что в качестве осадителей ферментных препаратов используют сульфат аммония. Препараты перед лиоАильной сушкой подвергают диализу против холодной дистиллированной воды.

В 20-литровый стеклянный аппарат марки Simax, снабженный линией для охлаждения рассолом, мешалкой и термометром, помещают 10 л водного экстракта, полученного из 1,5 кг Амилоризина ПХ. Пускают в ход мешалку и при рН 7,0 и температуре 2 С небольшими порциями добавляют сульфат аммония до получения 50Х насыщения последнего и оставляют при 2-5 C в течение

16 ч. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин, растворяют в минимальном объеме воды и переносят в целлофановую пленку (сосисочную) и осуществляют диализ против холодной воды до полного удаления сульфат-иона. Отсутствие сульфат-иона проверяют 20Х хлористого бария. Содержимое диалиэиого мешка сушат лиофил ьно, Протеолитическая активность ферментного препарата 29,0 ед/г. Выход по активности 23 OX.

Супернатант переносят в аппарат и в описанных условиях добавляют сульфат аммония до получения 60 . насыщения последнего.

Отключают мешалку и оставляют при

2-5 С в течение 16 ч.

Выпавший осадок, представлякиций собой ферментный препарат аминоацила зы, подвергают диализу и сушат лио-. фильно, как описано выше.

5 165433

Аминоацилазная активность препарата 850 ед/г. Выход продукта по актинности 857.

Супернатант после выделения аминоацилазы переносят в аппарат и при опи- 5 санных условиях продолжают добавление до получения 807. насыщения сульфатом аммония. Отключают мешалку и содержимое аппарата оставляют при 2-5 C в те0

10 чение 16 ч.

Выпавший осадок, представляющий собой ферментный препарат амилазы, отделяют, подвергают диалиэу и лиофильно сушат, как описано выше.

Амилолитическая активность препарата 12000 ед/г. Выход продукта по активности 217.

Пример 4. Процесс проводят аналогично примеру 3 с той разницей, 70 что высушивание ферментных препаратов осуществляют этанолом непосредственно после осаждения, минуя стадию диализа.

Для этого мокрые ферментны ° препа-, раты из центрифужных стаканов переносят н гомогениэатор, добавляют охлажденный до минус 8-1L) Ñ этанол из расчета 25-30 мп на 1 ) r препарата и гомогенизируют н течение 3-5 мин. Фильтруют на воронке Бюхнера и сушат на воздухе в течение 10-12 ч.

Акти ность ферментных препаратов протеазы, аминоацилаэы и амилаэы составляет 19,0, 587; !1000 ед/г, а выход 29, 71, 257 соответственно.

Пример 5. Процесс осущестнля35 ют аналогично примеру 1 с той разницей, что ферментные препараты получают в промышпенньм условиях из водного экстракта биомассы А.oryzae, нь)ращенной поверхностным способом. Экстракцию проводят водопроводной водой, осаждение осуществляют непрерывно при 7-12 С, препараты выделяют на сепараторе-кларификаторе при 4,И об/мин 45 и после лиофильной сушки подвергают дроблению.

В экстрактор емкостью /00 л, снабженный механической мешалкой, помещают 120 кг биомассы А.oryzae влажностью 40Х, выращенной на пшеничных отрубях добавляют 450 л водопроводной воФ о ды с температурой 30 С, пускают в ход мешалку и осуществляют экстракцию в течение 1 ч. Затем насосом экстракт подают на фильтр-пресс, где осуществляют отделение биошрота от вытяжки.

Вытяжка поступает н напорный бак для загрязненной вытяжки, отхлаждается

5 6 до 50С и оттуда поступает на центрифугу, где при 300() об/мин очищается от взвешенных частиц.

Очищенная вытяжка поступает в на порный бак очищенной нытяжки и оттуда через ротаметр н смесительную колонну диаметром 70 мм, высотой

1000 мм. В эту же колонну из другого напорного бака через холодильник и другой ротаметр поступает этиловый о спирт с температурой минус 10-12 С.

В смесительной колонне экстракт непрерывно смешивается с этанолом, при этом часть ферментов, присутствующих н экстракте, выпадает в осадок. Процентное соотношение этанола н отходящей водно-спиртовой смеси составляет 407. Осаждение происходит при 11-12 С. Суспензия ферментов в, о водно-спиртовой смеси из смесителя непрерывно поступает на сепараторкларификатор, где при 4170 об/мин отделяется от последней.

Осадок, представляющий собой hepментный препарат с протеаэной активностью, выгружают иэ сепаратора-кларификатора на раскладочный стол, затем на кюветы. Кюветы с препаратом устанавливают н камеру морозильного э стола и эамораживают до минус 30 С.

Затем препарат сушат н течение 1 )14 ч н сублимационной сушилке марки

КС-30 до температуры продукта 20 С °

Сухой препарат протеазы выгружают из сублимационной сушилки и подвергают дроблению на дробилке марки

ДДК-ЗЬ.

Протеолитическая активность ферментного препарата, названного Проторизин, равна 31 ед/г. Выход препарата по активности составляет 45Х.

Водно-спиртовой раствор после выделения ферментного препарата поступает в другой напорный бак, снабженный змеевиком, линиями рассола и воздуха, где при перемешивании воздухом охлаждается до 3-5 C. Hs этого напорного бака водно-спиртовая смесь через ротаметр поступает в смесительную колонну, где подвергается осаящению.

Осаждение ферментов, их ныделение, сушка и дробление осуществляются, как описано выше. Температура осаждения о составляет 8-10 С, а содержание этанола в смеси 50Х.

Ферментный препарат обладает аминоацилазной активностью, равной

650 ед/г. Выход по активности 76Х.

1654335

Составитель В.Варламов

Техред Л.Олийнык Корректор А.Обручар

Редактор Н. Гунько

Заказ 1930 Тираж 372 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж"35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина, 101

Водно-спиртовой раствор после выделения ферментных препаратов протеаэы и аминоацилаэы поступает в напорный бак и оттуда, охлажденный до 35 С, через ротаметр поступает в смесительную колонну и подвергается осаждению. Осаждение ферментов, их выделение, сушка и дробление осуществляются, как описано выше. Температура осаждения 7-8 С, а содержание спирта ,в смеси 72Х.

Амилолитическая. активность препарата составляет 6000 ед/г. Выход по активности 82Х.

f5 ,ФормУла изобретения

Способ выделения ферментных препаратов аминоацилаэы, амилаз и проте

as из Aspergillus oryzae, включающий водную экстракцию исходного сырья, фракционирование спиртом или сульфатом аммония и сушку препаратов, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса с одновременным повышением активностей ферментных препаратов, в качестве исходного сырья .используют Амилоризин

ПХ илй поверхностную культуру его продуцента, а при фракционировании спиртом устанавливают концентрации:

35-40Х для выделения протеазы, 45-50Х для аминоацилазы, 72-75Х для амилаэы или 50Х, 60Х и 8<)X насыщения соответственно при фракционировании сульфатом аммония.