Штамм sтrертомyсеs fradiae - продуцент рестриктазы sfr i

 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Целью изобретения является выявление ново го штамма - продуцента Streptomvces fradiae В1СПМ S-866, нетребовательно2X/ го к питательным средам и синтезирующего одну рестриктазу, способную узнавать и расцеплять последовательность нуклеотидов CCGCGG с высоким выходом0 Штамм получен в результате поиска продуцентов рестрпктаз среди микроорганизмов группы стрептомицетов, растет на простой дешевой питательной среде отечественного производства, обеспечивает повышенный выход рестриктазы при более простом экономическом способе выделения фермента по сравнению с известной Из 1 г влажной биомассы выделяют 30000-35000 уд, фермента с удельной активностью 30000 ед/мл,- Ытамм Streptomyres fradiae (303) S-866 продуцирует рестриктазу Sfr I, имеет сайт узнавания CCGCGG, идентич- HLDI сайту узнавания Sac .II, и может заменить Sac II во всех генно-инженерных работах„ % Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) 1645300 А 1 щ) С 12 N 9/14 1/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4615754/13 (22) 06„12.88 (46) 30.04.91. Бюл., N 16 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных в< ществ (72) Л.И. Пучкова, Г„Н. КртФопалова, С.Х. Дегтярев, H.-И. Речкунова, А.В. Селина, И.С„ Андреева и Г,Д.Серов (53) 577.15(088„8) (56) Uani А.А., et al, "А недотеп«specif ic endonuclease Ггог< I1icrococcus radiodurans. — 1982, 697, р. 178184. . (54) 1<1ТАИ1<1 БТКЕРТОМУСЕБ FRADIAE

ПРОДУЦЕНТ РВСТРИКТАЗЫ 8?г I. (57) Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Целью изобретения является вь<явление ново-! го штамма — продуце нта S t ге р t nmy < е s

f radiac ВКПИ S-866, нетребовательноИзобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к выявлению микроорганизма, способного синтезировать эндонуклеазу рестрикции, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов CCGCGG и названную согласно обш принятой номенклатуре Sfr I.

Цель изобретения — выявление штамма — продуцента 8(.гер ошусез fradiae BKIl11 S-866 (303), нетребовательного к питательным средам и синтезируюцего одну рестриктазу, способную узнавать и расщеплять последователь!

2 ч го к питательным средам и синтезирующего одну рестриктазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов СССССС с высоким выходом.

Ытами нолучен в результате поиска продуцентов рестрпктаз среди микроорганизмов группы стрептомицетов, растет на простой дешевой питательной среде

c)T< .÷ecòíåïíîã< производства, обеспечивает и вышенпый выход рестриктазы при более простом экономическом способе выделения фермента по сравнению с известной Из 1 г влажной биомассы выделяют 30000-35000 уд, фермента с

I удельной актши.остью 30000 ед/мл, Ытамм S treptomy<.es 1radiae (303) С2

S-86б продуцирует peñòðèêòàçó Sfr I, имеет сайт узнавания СССССС, идентичный сайту узнавания Sac II, и может заменить S«c II во всех генно-инженерных работах. фъ ность нуклеотидов CCGCCG с высоким © выходом

М

1,(тамм S. f radiac 303 получен в ре- О зуль тате поиска продуцентов рестрик- 4Р таз среди микроорганизмов группы стрептомицетов.

Предлагаемый штамм обладает следующими свойствами., 11орфологические: клетки нитевид- Й ные, неподвижные, грамположительные, на крахмало-аммиачной среде образуют вросшие колонии; воздушный мицелий белый или серо-розовый, субстрата(й— грязно-желтоватый. Споры овальные, 1645300

45 спороносцы спиральные. На глицериннитратном агаре: воэдушньпЪ мицелий (ВГ1) — желтовато-белый, субстратный мицелий (СИ) — желтовато-рыжеватый

5 растворимьп пигмент (РП) — отсутствует.

На рыбно-питательном агаре: ВМ— отсутствует, колонии кожи гого типа;

СИ вЂ” рыжеватый; РП вЂ” нет. 1О

На овсяном агаре: ВМ вЂ” серо-розовый, СИ вЂ” желтовато-бурый, РП вЂ” нет.

На минеральном агаре: ВМ вЂ” белорозовый, СИ вЂ” желто-розовый; РП вЂ” нет. физиологические и биохимические 15 свойства. "факультативный аэроб, теьгпературный оптимум 30 С, рН среды

7,0-7,5. Культура ферментирует глюкозу, галактозу, арабинозу, салицин; восстанавливает нитраты, разжижает 20 желатин, не выделяет индол, сероводород, амилаэоположителен, тирозин не ферментирует. Обладает антагонизмом по отношению к грамположительным н грамотрицательныч бактериям, но не 25 к дрожжам. Меланоидные пигменты не образует. штамм не усваивает маннит, иноэит, сахарозу: слабо усваивает рафиноэу, обладает амилазной и желатинаэной ак- 30 тивностью, растет на клетчатке; не содержит тирозиназу.

Устойчивость к антибиотикам: штамм устойчив к пенициллину, мономицину, неомицину, карбенициллину, оксациллину, ампициллину, сульфатиаэолу. штамм хранится в лиофильно-высуыенном состоянии и в растворе ЭОЖ-го глицерина при -60 С.

Для культивирования S.fradiae 303 40 применяют питательную среду следующего состава, г/л дистиллированной воды: БВК 20, NaC1 5,0; глюкоза 3,0; рН 7,2. Культивирование проводят при

30 С с хорошей аэрацией в течение

48 ч. Выход сырой биомассы составляет в среднем 40 г/л культуральной жидкости.

Выход фермента составляет 3000035000 ед.акт./г влажной биомассы, что в 15-17 раз больше, чем известного.

Полученная рестриктаза .Sfr I характеризуется следующими свойствами: узнает и специфически расцепляют последовательность нуклеотидов CCGCGG„ оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5-8,0; оптимальная температура действия 37 С, активность о сохраняется также при 50 С; оптимальо ная концентрация ионов Itg+ 5-15 мИ.

NaC1 50 АЙ@1.

Электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага 3 Cl 857 рестриктазами

Sfr I u Sac II u Sac II показывает, что картина гидролиэа полностью совпадает как при параллельном, так и совместном гидролизе. Следовательно, рестриктаэа Sfr I является изошиэоме,ром рестриктаэы Sac II, узнает и расцепляет последовательность нуклеотидов CCGCGG.

Пример 1. Получение биомассы.

S. йradiae 303. Клетки S. fradiae 303, храняциеся в ЗОХ-ном растворе глицерина в, питательной среде при -20 С, о высевают на чашку с плотной питательной средой и инкубнруют при 30 С в течение 44-48 ч. Затеи клетки вносят бактериологической петлей в колбу с

50 мп жидкой питательной среды, г/л дистиллированной воды: БВК 20 г/л;

NaCl 5,0 г/л, глюкоза 3,3 г/л; рН 7,2 и выращивают на качалке при 30 С в течение 30 ч. Полученную культуру используют для засева 200 мп среды.

Выращивание проводят также на качалке со скоростью 150-200 об/мин в течение 48 ч. Клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин на центрифуге "11istral". Выход сырой биомассы составляет 38 г/л культуральной жидкости.

Пример 2. Выделение сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции

Sfr I.

10 г влажной биомассы суспендируют в 30 мл 0,01 М калий-фосфатного буфера рН 7,5, содержащего 0,01 М 2-меркаптоэтанол и 1 мГ1 ЭДТА, озвучивают на дезинтеграторе УЗНД-2T в диапазоне

22 кГц 4-8 раз по 30 с, с таким же интервалом центрифугируют (18000 об/мин

60 мин., 4 С) и к полученному супернатанту добавляют сульфат аммония до 75Х-го насыщения. Суспенэию выдерживают 18 ч при 4 С и центрифугируют.

Полученный осадок растворяют в 20 мл

0,02 И калий-фосфатного буфера, содержацего 1 мИ 2-меркаптоэтанол, 0,5 мМ

ЭДТА, 0,1Ы тритон Х-100 и 0,8 М йаС1 (буфер А). Раствор наносят на колонку с биогелем А 0,5 М (Вьо Кай), объемом

500 мл, уравновешенную буфером А, и ведут элюцию тем же буфером со скоростью 20 мл/ч. Фракции объемом 10 мп собирают и анализируют на наличие

5300 с> о р и у л а изобретения

Составитель И. Привалова

Техред М,Дидык Корректор M. Шароши

Редактор И. Касарда

Заказ 1322 Тираж 377 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР

1!3035, Москва, Ж-З5, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

164 фермента. Фракции, содержащие максимальную рестриктазную активность, объединяют и диалнэуют против 2 л

0,02 11 калий-фосфатного буфера рН

7,5, содержащего l м11 2-меркаптоэтанол и 0,5 мМ ЭДТА (буфер В), меняя буфер дважды. Диалиэуит, наносят на колонку объемом 30 мл с ДЕАЕ-целлюлозой (ДЕ-52, Whatman), уравновешенную буфером В. Колонку промывают буфером

В и адсорбированный фермент элюируют 300 мл градиента NaC1 (Э, J1-1,0 М) в буфере В. Фермент после диализа наносят на колонку с фосфоцеллюлозой (P-II, Whatman) объемом 10 мп, уравновешенную буфером В, и промывают колонку тем же буфером. Элюцию фермента проводят 200 мл градиента

ПаС1 (0,0-1,0 11) в буфере В„ Фракции, содержащие рестриктазу, элюируют при 0,60-0,07 М NaC1, объединяют и диализуют против буфера В, содержацего 0,1 М ИаС1 и 507.-ный глицерин., Ферментный препарат хранится при

-20 С не менее 6 мес., хорошо транс0 портируется в термосе с сухим льдом„

Выход фермента ЗОЭЭЭ ед.акт/г биомассы активность ЗОЭЭО ед/мл.

За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое „цля полного расцеплеипя

1 мкг )Ц1К фага ф С1 857 в течение

1 ч при 37 С„

Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой

Sfr I.

Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестрик10 тазой Sfr I, проводят гидролиз ДНК фага 9, С1 857 рестриктазами Ыг Т и Sac II по отдельности, а также совместный гидролиз этими рестриктазами.

Наблюдаемая картина полного совпаде15 ния фрагментов, полученных при параллельном и совместном гидролизе, указывает »а то, что рестриктаэа Sfr I является изонизомером рестриктазы

Sac II, узнает н расщепляет последовательность СССССС.

Поскольку рестриктаза Sfr I, имеет сайт узнавания CCGCGG, идентичный сайту узнавания Бас ?1, она может заменить Sac II a экспериментах по фрагментации ДНК по этим сайтам.

ЗО затаим Streptomyces 1гад ае ВКПМ

S-866 — продуцент рестриктазы Sfr