Штамм бактерий рsеudомоnаs sтuтzеri - продуцент рестриктазы psu i

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генной инженерии и молекулярной биологии. Цель изобретения - получение штамма Pseudomonas stutzerl В-4727 (t31), обладающего более высоким уровнем синтеза рестриктазы, узнающей палиндромную S CGAfCGS1 последовательность :1 и являю3 GCTAGCS щейся гомогенно чистой. Штамм культивируют на среде 3 с рыбным гидролизатом. В результате использования штамма Pseudomonas stutzeri ВКПМ В-4727 выход биомассы составляет 6,0-7,5 г/л культуральной жидкости, а выход рестриктазы Psu 16000-9000 ед/г биомассы или 36000-67500 ед/л культурэльной жидкости. 1 табл. ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51)5 С 12 N 9/14

ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

{21) 4706937/13 (22) 19.06.89 (46) 30.05.91. Бюл. N. 20 (71) Научно-производственное объединение

"Биолар" и Научно-производственное объединение "Вектор" (72) IQ.Н.Бойков, В.Е.Репин, C.Õ, Дегтярев и

З.А.Виестуре (53) 577.115(088.8)

{56) Clngeras N.R., Green()ugh Schildkraut

1., Roberts ВЛ, Two new restriction endonucleases

from Proteus vulgar1s. — 1Nucieis Acids Res„

1981, ч.9, N. 18, р, 4525 — 4536. (54) ШТАМ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS

STUTZER1 — П РОДУЦЕ НТ РЕСТРИ КТАЗЫ

PSU 1

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм, который может быть использован для получения рестриктазы- Psu 1

Цель изобретения — получение штамма

Pseudomonas stutzeri (131) ВКПМ В-4727, обладающего более высоким уровнем синтеза рестриктазы, узнающей палиндромную, 5 CGATCG3 последовательность и являю3(6 СТАО С5 щейся гомогенно чистой.

Штамм Pseudomonas stutzeri (131)

ВКПМ В-4727 выделен из почвы с последующим отбором вариантов, имеющих высокую продуктивность рестриктазы Psu 3.

Штамм имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки.

Клетки одиночные, палочковидные, прямые или изогнутые, но не спиральные, раз(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генной инженерии и молекулярной биологии. Цель изобретения — получение штамма

Pseudomonas stutzeri В-4727 (131), обладающего более высоким уровнем синтеза рестриктазы, узнающей палиндромную

51саА Саз последовательность и являю"

3 GCTAGC5 щейся гомогенно чистой, Штамм культивируют на среде 3 с рыбным гидролизатом, В результате использования штамма

Pseudomonas stutzeri ВКПМ В-4727 выход биомассы составляет 6,0-7,5 г/л культуральной жидкости, а выход рестриктазы Psu

16000 — 9000 ед/г биомассы или 36000-67500 ед/л культуральной жидкости. 1 табл. меры 0,5 — 1 х 1,5-4 мкм, движутся с помощью поля рных жгути ков. Грамотрицательные.

Физиолого-химические признаки, Метаболизм дыхательный (ассимилируют глюкозу на среде Хью-Лейфсона по окислительному типу), обладает уреазной и аргининдегидролазной активностью, Пигментов не содержит, растет при 430 С, не растет при 42 С (оптимальная температура роста 25ОС).

Леван из сахарозы .не образуется, не разжижает желатину и не гидролизует полиР -оксибутират, гидролизует крахмал.

В качестве единственного источника углерода может использовать глюкозу, L-валин, ацетат, цитрат и не использует трегалоэу, 2-кетоглюконат, мезо-инозит, Р

1652341

-аланин, Dl=aprww. При ассимиляции гпекозы образуется кислота.

Сероводород не образуется, реакция

Фогес-Проскауэра отрицательная, тест с метиловым красным отрицательный, 5

Фенилпируват не образуется (реакция на наличие фенилаланиндезаминазы отрицательная).

Факультативные аэробы. Оксидазо- и каталазоположительные. 10

Кул ьтурал ьн ые признаки.

Рост на косяках густой, сплошной.

Штрих широкий, четко видный. При попадвник на твердую среду влаги растет в виде сплошной пленки по всей поверхности. При 15 выращиваний культуры в чашках Петри на твердой среде через 24 ч образуются полупрозрачные точечные колонии размером

0,1-0,2 мм. Через 38 ч образуются белые, круглые, полупрозрачные. совершенно 20 гладкие, влажные, однородные, выпуклые. блестящие с гладким краем колонии,. РазМер таких колоний в диаметре 2-2,5 мм. flo всей консистенции они являются маслянистыми (подобие сливочного масла). 25

Колонии не пигментированы.

Штамм Pseudomonas stutzerl 131 имеет сильный запах при росте на твердой или жидкой среде.

При росте в бульоне образуется обиль- 30 ный осадок.

Хорошо растет на жидкой питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидроли-. зата и до 1,0 л воды, рН 7.2-7,4. Нв такой питательной среде штамм растет при тем- 35 пературе 25-27 С, аэрации 2 обьемв воздуха на 1 обьем питательной среды в течение

5 — 6 ч. При выращивании штамма на питательной среде данного состава происходит помутнение среды, что свидетельствует о 40 сильном росте культуры. Рост глубинный и пленки на поверхности не образуется. Осадок, состоящий из клеток Pseudomonas

stutzeri 131, тягучий, при воздействии нв него лизоцимом быстро происходит лизис 45 клеток. Количество осадка обильное, цвет осадка светло-серый.

Штамм фагоустойчив. Не лиэируется в присутствии фагов Ch 4A, À, MS 2, Q Р.

Штамм чувствителен к ампициллину в концентрации 25 мкг/ма. Штамм дает вы- 50 ход биомассы 6.0-7,5 г/л культуральной жидкости, имеет выход рестриктазы Psu Х

6000-9000 ед/г биомассы или 36000-67500 ед/л культуральной жидкости, биосинтезирует одну сайт-специфическую эндонуклеа- 55 зу Psu 1, являющуюся гомогенно чистой.

Выращивают культуру на питательной среде известного состава при рН 7,2, температуре 25ОС, аэрации 2 обьема к 1 обьему питательной среды до поздней логарифмической фазы роста.-Выход биомассы 6,0 — 7,5 л/г культуральной жидкости; выход рестриктазы Psu I 3000 — 4500 ед/г биомассы или 18000 — 33750 ед/л культуральной жидкости.

Сравнение уровней продуктивности штаммов — продуцентов рестриктаэ — иэошиэомеров рестриктазы Psu 1 представлены в таблице.

Пример. Штамм бактерий .Pseudornonas stutzeri 131 выделен из почвы.

Для получения изолированных колоний берут 10 r почвы (иэ расчета абсолютно сухой) и взбалтывают с 90 мл воды в течение 5 мин.

В дальнейшем используют метод предельных разведений, заключающийся в последовательном переносе 1 мл суспензии в пробирку с 10 мл стерильной воды, хорошо перемешивают и из данной пробирки 1 мл суспензии переносят во вторую пробирку и т,д. Всего делают 8 — 9 разведений, из каждого разведения производят посев 0,1 мл суспензии s чашки Петри . с твердой питательной средой, содержащей 3.5Q суxoro питательного агара и воду).

Все выросшие в чашках Петри колонии изучают микроскопически на наличие биохимических признаков, в том числе на наличие активности рестркктазы Psu 2.

Полученные колонии Pseudomonas stutzeri в активностью фермента Psu I селекционируют с целью получения наиболее активных вариантов.

Проверку продуктивности штамма бактерий Pseudomonas stutzeri (131) ВКПМ В4727 ведут в сравнении со штаммом Proteus

vulgaris АТСС 133115 ВКПМ В-1804, который синтезируют аналогично рестриктазу и экспериментально проверен в лабораторных условиях на НПО "Биолар".

Готовят среду для выращивания штамма следующего состава: 50 г/л рыбного гидролизата к 1,0 л воды.

Оживление штамма Rseudomonas

stutzer! 131 осуществляют на сухом питательном агаре (35 г/л сухого питательного агара и 1,0 л воды) в чашках Петри. Инкубируют в термокамере при 26 С в течение

18 ч.

С поверхности агара в чашках Петри культуру переносят бактериологической петлей в качалочные колбы с питательной средой данного состава, рН 7,2, Выращивают посевной материал при

26 С в течение 18 ч на качалке.

Ферментацию культуры проводят на питательной среде данного состава при рН

7,2, температуре 26 С, перемешивании 200

1652341

Составитель И.Чаплина

Редактор M.nåòðîâà Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Т.Малец

Заказ 1747 Тираж 371 .. Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 об/мин, подаче воздуха — 2 объема воздуха на 1 объем питательной среды.

Выращивают до поздней логарифмической фазы роста, Выход биомассы 6,0-7,5 г/л культуральной жидкости, выход ре- 5 стриктазы Psug 6000-9000 ед/г биомассы или 36000-67500 ед/л культуральной жидкости, Таким образом, при использовании штамма Pseudomonas stutzerl (131) ВКПМ

В-4727 по сравнению с известным способом выход рестриктазы Psu 1 возрастает с 1000 до 6000-9000 ед/г биомассы.

Формула изобретения

Штамм бактерий Pseudomonas stutzeri

ВКПМ В-4727- продуцент рестриктазы PsuI.,