Способ получения ферментов из биомассы bacillus амylоliquеfасiеns штамм вкпм в-3188
Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано для получения ферментов нуклеинового обмена, в частности эндо-и экзонуклаз. Целью изобретения является повышение степени чистоты целевых продуктов и степени использования исходной биомассы. Способ заключается в том, что биомассу B. AMYLOLIGUEFACIENS штамм ВКПМ В-3188 разрушают, клеточный экстракт после хроматографии на фосфоцеллюлозе подвергают дополнительной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Фракции, содержащие активность эндонуклеазы BAM HI, подвергают очистке на гидроксиапатите и BIO-REX 70, а фракции, содержащие экзонуклеазу Ш, подвергают очистке на аминогексилсефарозе и ДНК-целлюлозе. Из 100 г биомассы получают 2,5 мг рестриктазы BAM HI с удельной активностью 493600 ед/мг и 40 мг экзонуклеазы Ш с удельной активностью 1350 ед/мг. 2 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4718569/13 (22) 11.07.89 (46) 07.07;91. Бюл. ¹ 25 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научнопроизводственного объединения "Вектор" и Научно-производственное объединение "Биолар" (72) Н.А.Чикаев, И.А. Назаренко, Л.В.Мацкова, Ю.Н.Бойков и Э.Г.Малыгин (53) 577,15(088.8) (56) Richardson С.С, и Kornberg А. А Deoxyribonucl6Ic Aeiol Phosphafase— Exonuelease from Escherichia coli, Jourtnal of Biological Chemistry, 1964, ч.239, ¹ 1, р.242 †2. Smithh Z.À. и Chirikjian J.G. Rerif ication and Characterization of the Sefuence-Specific Endonuclease BamHI, Journal of Biological Chemistry, 1979, ч.254, № 4, р.1003 — 1006. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ ИЗ БИОМАССЫ BACILLUS AMYL0LIQUEFACIENS ШТАММ ВКПМ В3188 Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано для получения ферментов нуклеинового обмена, в частности андо- и экзонуклеаз, которые находят широкое применение в генной инженерии для анализа и конструирования рекомбинатных ДНК. Целью изобретения является повышение чистоты целевых продуктов и степени использования исходной биомассы. Способ заключается в том, что биомассу В.amyloliquefaciens штамм ВКПМ В-3188 разрушают, клеточный экстракт после хро„„5U „„1661211 А1 (57) Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано для получения ферментов нуклеинового обмена, в частности эндо- и экзонуклаз. Целью изобретения является повышение степени чистоты целевых продуктов и степени использования исходной биомассы. Способ заключается в том, что биомассу В. amyloliquefaciens штамм ВКПМ В-3188 разрушают. клеточный экстракт после хроматографии на фосфоцеллюлозе подвергают дополнительной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Фракции, содержащие активность эндонуклеазы Bam Hl, подвергают очистке на гидроксиапатите и В io-Rex 70, а фракции, содержащие экзонуклеазу Ш, подвергают очистке на аминогексилсефарозе и ДНК-целлюлозе. Из 100 r биомассы получают 2,5 мг рестриктазы Bam Hl с удельной активностью 493600 ед/мг и 40 мг экзонуклеазы Ш с удельной активностью 1350 ед/мг. 2 табл. матографии на фосфоцеллюлозе подвергают дополнительной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Активность зндонуклеазы Bam Hl обнаруживается во фракциях, элюируемых 0,1 — 0,2 М NaCI, а фракции, содержащие экзонуклеазную активность, элюируются 0,05 — 0,1 М NaCI. Дальнейшую очистку Bam Hi осуществляют хроматографиями на колонках с гидроксиапатитом и Bio-Rex 70. В результате получают препарат Bam Н, очищенный в 1720 раз, с удельной активностью 493600 ед.акт./мг белка, где за 1 ед.акт. принято 1661211 55 количество белка, катализирующее расщепление 1 мкг ДНК бактериофага за 1 ч при 37 С в буфере (6 MM трисНС!, рН 7,5), содержащем 6 мМ MgCI2 и 6 мМ j3-меркаптоэтанол. Для получения электрофоретически гомогенного препарата экзонуклеазы фракции с. колонки с ДЭАЭ-целлюлозой, содержащие экзонуклеазную активность, очищают дополнительно на колонках с аминогексилсефарозой и ДНК-целлюлозой. Исследование свойств полученной экзонуклеазы показывает, что фермент имеет мол.м, 29 КД, является 3 -экзонуклеазой, специфичной к двуспиральной ДН К, и обладает дополнительно активностями; РНКазы Н, 3 -фосфатазы и АР-эндонуклеазы. Изучение обнаруженной в В,агпу!oliquefгс!епв штамм ВКПМ В-3188 .экзонуклеазы показывает, что фермент является аналогом экзонуклеазы ill Е.со!!, но обладает повышенной специфичностью к структуре 3 -конца ДНК по сравнению с экзонуклеазой ill E.col!, Это обеспечивает преимущество использования экзонуклеазы III В.amyloliqvefaciens в генноинженерных и биотехнологических экспериментах. . :!,эимеры конкретного выполнения cnocîáà приведены ниже. Пример 1. Выделение экзонуклеазы Ill и эндонуклеазы Bam HI из В.amyioliquefacien s. Получение клеточного экстракта. 100 r биомассы В.amylollquefaciens штамм ВКПМ В-3188 размораживают и суспендируют в буфере (200 мМ трисНС!, рН 7,5), содержащем 5 мМ Р -меркаптоэтанол (буфер Б). К суспензии добавляют 2 мл раствора лизоцима(10мт/мл) в буфере(1 М трисНС!, рН 7,5) и лизис клеток проводят в течение i ч. Лизат обрабатывают ультразвуком при 200 — 300 Вт, 20 кГц (10x30 см, при охлаждении ) и центрифугируют при 20000 С в течение 1 ч. Хроматография на фосфоцеллюлозе P-l l. Клеточный экстракт наносят на колонку с фосфоцеллюлозой (2,6х25 см), уравновешенную буфером Б, колонку промывают 0,5 л буфера Б и белок элюируют 2 л линейного градиента йаС! от 0 до 0,5 M в буфере Б. Скорость нанесения, промывки и элюции 30 мл/ч. Экзонуклеаза !!! элюируется на этой стадии совместно с рестриктазой Bam Hl при 0,3 — 0,5 M NaCI. Фракции, содержащие обе.эти активности, объединяют, осаждают белки добавлением сульфата аммония до 70 Д насыщения. Сформировавшийся в течение 15 ч осадок отделяют центрифугированием при 20000g в течение 30 мин, 5 40 растворяют в 90 мл буфера Б и диализуют против 4 л того же буфера в течение 10 ч, Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе (разделение Bam Hl и экзонуклеазы !!!). Раствор фермента после диализа освобождают от выпавшего осадка центрифугированием и наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (1,6х40 см), уравновешенную буфером Б. Колонку промывают 200 мл буфера Б, белки элюируют линейным градиентом концент- . рации NaCI 0 — 0,4 M в том же буфере. Общий объем градиента 400 мл. Фракции в интервале 0,05-0,1 M NaCI содержат свободную от Bam Hl экзонуклеазу lll, эндонуклеаза Вав Hi элюируется 0,1-0,2 М NaCI. Фракции, содержащие экзонуклеазу III, подвергают дальнейшей очистке. Хроматография экзонуклеазы !i! на гидроксиапатите. Препара экзонуклеазы III после ДЭАЭцеллюлозной хроматографии наносят на колонку с гидроксиапатитом (1,6х5 см), уравновешенную 10 мМ калийфосфатным буфером, рН 7, содержащим 10 мМ Р-меркаптоэтанол (буфер В). Колонку промывают 50 мл буфера В и фермент элюируют калийфосфатным буфером, рН 7, содержащим 10 мМ Р -меркаптоэтанол, с градиентом фосфата калия от 0,01 до 0,6 М. Общий объем градиента 60 мл. Скорость чанесения, промывки и элюции 3 мл/ч, Фракции, содержащие экзонуклеазу (0,18 — 0,25 М К-фосфата), объединяют и диализуют в течение 12 ч против 1 л буфера Б, Хроматография экзонуклеазы ill на амин огексилсефа розе, Полученный диализат в количестве 10 мл наносят на колонку с аминогексилсефарозой (0,8 — 20 см), уравновешенную буфером Б. Колонку промывают 20 мл буфера Б, фермент элюируют градиентом концентрации NaCI Π— 0,75 М в буфере Б. Общий объем градиента 150 мл. Скорость нанесения, промывки и элюции 3 мл/ч, Фракции, содержащие экзонуклеазу, элюируемые в градиенте NaCI 0,14 — 0,18 М, объединяют и диамезуют в течение 12 ч против 1 л буфера Б. Хроматография на аминогексилсефарозе обеспечивает 10-кратную очистку фермента при полном сохранении экзонуклеазной активности. Хроматография на ДНК-целлюлозе. Раствор фермента после диализа наносят на колонку с ДНК-целлюлозой (0,5x10 см), уравновешенную буфером Б. Колонку промывают 20 мл буфера Б и элюиоуют линейным градиентом NaCI 0 — 1 M в том же буфере, Общий объем градиента 20 1661211 10 20 мл, Скорость нанесения, промывки и элюции 1 мл/ч, Фракции, содержащие фермент (0,25 — 0,45 M NaCI), объединяют и концентрируют диализом против 100 мл буфера Б с 50 -ным глицерином. Таким образом, из 100 г биомассы В.amylollquefaciens штамм ВКПМ В-3188 получают 0,04 мг электрофоретически гомогенной экзонуклеазы с удельной активностью 1350 ед,акт./мг, измеренной по методу Ричардсона. Препарат эндонуклеазы Bam Hl, отделившийся от экзонуклеазы III, после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе также подвергают дальнейшей очистке. Хроматография эндонуклеазы Bam Hl на гидроксиапатите. Препарат эндонуклеазы Bam Н! наносят на колонку с гидроксиапатитом (1,5х5 см), уравновешенную 10 мМ К-фосфатным буфером, рН 7, содержащим 0,1 M NaCI, 5 мМ Р -меркаптоэтанол. Колонку промывают 50 мл того же буфера, белок элюируют 60 мл линейного градиента К-фосфата калийфосфатнолго буфера, рН 7, от 0 01 до 0,6 М, содержащего 0,1 М NaCI и 5 мМ Р-меркаптоэтанол. Фракции, содержа- щие активность Bam HI, элюируются в интервале от 0,12 до 0,36 М К-фосфата. Хроматография эндонуклеазы Bam Hl на Bio-Rex 70. Объединеннйе фракции после хроматографии на гидроксиапатите диализуют в течение 20 ч против 1 л буфера Б, меняя буфер дважды, и наносят на колонку с BloRex 70 (0,8х5 см), уравновешенную буфером Б. Колонку промывают 20 мл того же буфера, элюцию белка осуществляют 60 мл линейного градиента NaCI от 0 до 1 М в буфере Б. Скорость нанесения, промывки и элюции 4 мл/ч. Фермент Bam Hl элюируют 0,1 — 0,35 M NaCl. Фракции, содержащие Bam Hl, объединяют и концентрируют диализом против byфера Б в 50 -ном глицерине. В результате из 100 г клеток Bacillus amyloliquefaciens получают 2,5 мг белка с удельной активностью 493600 ед.акт./мг белка. Данные по выделению Bam Hl эндонуклеазы приведены в табл.1. Проверка чистоты эндонуклеазы Bam Hl. Для проверки чистоты полученного препарата эндонуклеазы Bam Hl и его пригодности для генноинженерных и биотехнологических экспериментов используют реакцию рестрикции-сшивки-повторной рестрикции. Для этого 1 мкг ДНК фага il С!щ7 инкубируют с 15 ед, эндонуклеазы Ваа Hl в 10 мкл 6 мМ трисНС! буфере, 25 55 рН 7,5, содержащем 6 MM MgClz. 6 MM фмеркаптоэтанол и 0,1 М NaCI, в течение 1 ч при 37 С. Реакцию останавливают прогреванием при 65 С в течение 5 мин, добавляют 0,5 ед.акт, Т4 ДН К-лигазы и 1 мкл 300 мМ раствора ATP и инкубируют в течение 16 ч при 10 С. Затем проводят повторную рестрикцию эндонуклеазой Bam Hl. Продукты каждой из этих реакций анализируют электрофорезом в 1 -ном агарозном геле. Как видно из электрофореграммы, полученный препаратэндонуклеазы Bam Hl обеспечивает полную рестрикцию ДНК фага Х с образованием фрагментов ожидаемой длины. После добавления ДНК-лигазы происходит полная сшивка рестриктов. Повторная рестрикция продукта лигазной реакции приводят к образованию характерных фрагментов рестрикции. Данный тест показывает, что препарат Bam HI свободен от примесей экзонуклеаз, фосфатаз и неспецифических эндонуклеаз. Пример 2. Свойства экзонуклеазы В.amyloliquefac)ens, В данном примере приведены доказательства того, что экзонуклеаза, выделенная из В,amyloliquefaciens штамм ВКПМ В-3188, действительно принадлежит к классу гидролаз К.Ф, 3.1.11.2, кроме того, указаны ее преимущества перед экзонуклеазой lll Е.coli. Оп! еделение молекулярной массы. Молекулярную массу экзонуклеазы Ill определяют электрофоретически в 12,5 ном полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях. Молекулярная масса фермента составляет 29 КД. Экзонуклеазная активность. Для тестирования этой активности синтезируют следующий субстрат 5 -o(GpGpApTpGpApCpGpCpGpT рС) о (А р С р G р Т р CpCpTpApCpTpGpCpGpCpAp pGpCpT) 1 пмоль таких двуспиральных олигонуклеотидов инкубируют с 10 нг фермента в 10 мкл 6 мМ трисНС! буфере, рН 7.5, содержащем 6 мМ Mg Clz и 6 мМ Р -меркаптоэтанол, в течение 30 мин при 37 С. Продукты реакции разделяют электрофорезом в 20 ПААГ с 7 М мочевиной в 50 мМ трисборатном буфере, рН 8,2, содержащем 1 мМ ЭДТА. Меченые олигонуклеотиды идентифицируют с помощью радиоавтографии. При неполном гидролизе указанного олигодезоксинуклеотида исследуемой нуклеазой обнаруживают только один меченый продукт реакции, который, как показано с помощью ТСХ, представляет собой (5 — Р) dCMP. Из этих данных следует, что фермент 1661211 5 -d(CAGTT)AGGAUCCAUUUCAC d(GTCAA ТССТА66ТААА6Т6)-5 5 (5 - P) — меченой была либо верхняя, зг либо нижняя цепь гибрида. Условия реакции и анализ продуктов такие же, как описано в случае анализа экэонуклеазной активности. PHK в составе 10 гибрида гидролизуется полностью. От цепи ДНК отщепляется только 3 нуклеотида, т.е, гидролиз протекает лишь на участке, где олигонуклеотид-матрица спарена с олигодезоксинуклеотидом-затравкой; в дуплексе с 15 PHK ДНК остается полностью интактной. В контрольном эксперименте, где в качестве сусбтрата используют двуспиральный олигодезоксинуклеотид аналогичной структуры, обе цепи расщепляются одинаково, 20 Из всех проверенных субстратов лишь двуцепочечная ДНК и РНК в составе PHK— ДНК гибрида эффективно гидролизуется экзонуклеазой III В. amyloliquefaciens. Двуспирэльные РНК, тРНК и одноцепочечная 25 ДНК устойчивы к действию нуклеазы. AP-эндонуклеазная активность. Для выявления AP-эндонуклеаэной активности у экзонуклеазы В.amyloliquefaciens используют суперспиральную ДНК плазмиды pBR 30 322, Такая ДНК, обработанная 20 мМ ацетэтом натрия, рН 4,8, в течение 10 мин при 700 С, содержит 2 — 3 апуриновых сайта на молекулу и сохраняет суперспиральную структуру. При обработке такой ДНК андо35 нуклеазой, специфически расщепляющей апуриновые участки, происходит переход ДНК из суперспиральной в кольцевую форму, Такой переход легко выявить электрофорезом ДН К в 1 -ном агарозном геле, так как 40 подвижность кольцевой формы ДНК значительна меньше, чем суперспиральной. 1 мкг апуриниэованной ДНК фага pBR 322 инкубируют с 10 нг экзонуклеазой lli в 20 мкл 50 мМ трисНС! буфере, рН 8, содер45 жэщем 5 мМ СаС!г и 1 MM P -меркаптоэтанол, при 370 С в течение 30 мин. Продукты реакции разделяют электрофореэом в 1 ном агарозе и окрашивают этидиум бромидом (5 мкг/мл). Показано, что при этом 50 суперспиральная ДНК количественно переходит в кольцевую форму. 3 -фосфатазная активность. 3 -фосфатазную активность тестируют по увеличению затравочной активности ДНК, 55 содержащей фосфаты на 3 -конце, Такой субстрат получают, обрабатывая 200 мкг ДНК из тимуса теленка 10 мкг ДНКазы II (" SIgma", США) в 200 мкл 20 MM натрий е ацетатного буфере, рн 5, в течение 20 мин при 37 С. ДНК-азу удаляют фенольной эксработает по экзонуклеазному механизму, так как при эндонуклеаэном расщеплении среди продуктов неполного гидролиза в первую очередь обнаруживаются меченые олигонуклеотиды. Очевидно также, что нуклеаза отщепляет 5 -NMP, так как при отщеплении 3 -нуклеозид-моно осфатов P обнаруживается в составе (3 - P-) dTMP. г Таким образом, выделенная нуклеаза катализирует гидролиз двухцепочных олигодеокзсирибонуклеотидов в 3 5 направлении. Чтобы проверить является ли двуспиральная структура 3 -конца обязательным условием для проявления активности фермента, используют следующие о л и г о д е э о к с и н у к л е о т и д ы: d(GATCCGGGTCATCCAG) — N 1, d(AATTCTGGATGACGCG) — N 2, d(GGATGACGCG) — N- 3, d(TC6ACGC6ÒÑÀÒÑÑÒGÑA) — N - 4, Состав этих олигонуклеотидов позволяет получить дуплексы с идентичным средним участком и с различной структурой 3 -конца d(GATCCGCGTCATCCAG) d(G CGCAGTAGGTCTTAA) (А) d(GATCCGCGTCATCCAG) d(GCGCAGTAGG) А) (Б) С С Т d(TCGAC6CGTCATCC) d(GCGCAGTAGGTCTTAA) (В) Указанные двуспиральные олигонуклеотиды инкубируют с экзонуклеазой. Результаты анализа показывают, что эффективный гидролиз имеет место лишь в том случае, если 3 -конец спарен. Если же 3 -конец олигонуклеотида свободен или расплетен, то расщепления не наблюдается. Существенно, что уже два нуклеотида, выступающие с 3 -конца (дуплекс "Б", мечена верхняя цепь), делают субстрат нечувствительным к действию фермента. Конечными продуктами реакции является нуклеозидмонофосфаты и 5 — 6-членные олигонуклеотиды, Наличие последних связано с тем, что олигонуклеотиды такого размера в условиях реакции не способны образовывать двуспиральную структуру, необходимую для функционирования нуклеазы. Активность PHK-азы Н. Гомогенный препарат экзонуклеазы из В,amyioliquefaciens способен гидролизо вать не только двуспиральную ДНК, но и PHK в составе PHK-ДНК гибридов. РНК ДНК гибрид получают с помощью РНК и ол и мера зы,20-член н оr о олигодезоксинуклеотида в качеств матрицы и пентадезоксинуклеотида d(CACTT) в качестве затравки, 10 1661211 Таблица 1 Очистка эндонуклеазы рестрикции Bam Hl В ыход., Суммарная активность Суммарный белок, мг Степень очитки о Стадия очистки Удельная активность, ед. акт./мг белка 6969,3 124ИНЙ 1234000 287 100 Грубый экстрат Хроматография на фосфо целлюлозе Осаждение сульфатом аммония Хроматография на ДЭАЭ вЂ” целлюлозе Хроматография на гидроксиаппатите Хроматография на Bi o-Rex 70 662,3 271? 9,47 354 4802 16,73 20 7800 271,78 284,21 1719,87 15,3 81568 493600 62,4 2,5 61,7 тракцией, осаждают спйртом, высушивают и используют в качестве субстрата. 2 мкг ДНК, обработанной ДНК-азой !!, инкубируют с 10 нг экзонуклеазы 5 В.amyloliguefaciens в 20 мкл 20 мМ трисНС! буфере, рН 7, содержащем 10мМ MgCIz, при 37 С в течение 30 мин. После этого к реакционной смеси добавляют dATP, dGTP, dCTP в концентрации 0,4 мМ, С-dTTP (0,1 10 Ci/ììîëü) и 10 ед. акт. ДНК-полимеразы !, Меченые продукты реакции осаждают 10 ной трихлоруксусной кислотой при.0 С и кислотонерастворимую радиоактивность определяют на счетчике "Mark !!!" (" Nuclear 15 Chicago", США). Контролем. служит ДНК, содержащая 3 -фосфаты и необработанная экзонуклеазой III. Табл.2 иллюстрирует включение С TMP в ДНК, обработанную экзонуклеазой !!!, 20 Результаты убедительно, показывают, что при инкубации ДНК с экзонуклеазой В.amyloliquefaciens происходит отщепление 3 -концевых фосфатных групп. По механизму действия этот фермент 25 аналогичен экзонуклеазе !!! из Escherichla coll, Hacmophilus influenzae u Strepfococeus pneumoniae и в соответствии с рекомендациями Комисии по биохимической номенклатуре I UP AC-I U B может быть 30 отнесен к группе гидролаз 3.1.11.2. Высокая специфичность экзонуклеазы I I I В.Amyloliquefaciens к структуре 3 -конца субстрата является премуществом при использовании фермента для секвенирования 35 ДНК. В основе метода секвенирования с использованием экзонуклеазы !!! лежит получение фрагмента ДНК, один . из концов которого устойчив к экзонуклеаэному гидролизу. В случае экзо- 40 нуклеазы tll Е. coli такой конец должен содержать не менее четырех неспзренных оснований, а при использовании фермента из В,amyloligrafaclens достаточно двух, а может и одного. Этот факт позволяет расширить спектр рестриктаз, пригодных для получения фрагмента с выступающим 3 -концом, Таким образом. из 100 r В.amyloliquefaciens штамм ВКПМ В-3188 получают 2,5 мг рестриктазы Bam Hl ñ удельной активностью 493600 ед.акт./мг и 0,04 г электрофоретически гомогенной экзонуклеазы III с удельной активностью 1350 ед.акт./мг, Формула изобретения Способ получения ферментов из биомассы Bacillus amyloliquefaciens штамм ВКПМ В-3188. включающий разрушение клеток, получение клеточного экстракта, хроматографическое разделение экстракта на фосфоцеллюлозе P-II и хроматографическую очистку. отл и ч а ю щи и с я тем, что, с целью повышения чистоты целевых продуктов и степени использования исходнбй. биомассы, хроматографическую очистку осуществляют последовательно методом ионообменной хроматографии на ДЗАЭцеллюлозе в градиенте NaCI 0 — 0,4 М, после чего фракции, содержащие рестриктазу Bam Hl, очищают хроматографически на гидроксиапатите в градиенте фосфата калия 0,01 — 0,6 M и íà Bio-Rex 70 в градиенте йаС! 0 — 1 М, фракции, содержащие экзонуклеазу Ilt, очищают хроматографически на гидроксиапатите s градиенте фосфата калия 0,01— 0,6 M на аминогеколсефарозе в градиенте NaCI 0,14-0,18 M и на ДНК-целлюлозе в градиенте NaCI 0 — 1.М. 12 1661211 Таблица 2 3 — фосфатазная активность экзонуклеазы 1И В.amyloliquefaciens ВКПМ В-3188 Составитель А, Семенов Редактор М. Стрельникова Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Н. Король Заказ 2097 Тираж -- Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород. ул.Гагарина, 101
