Способ выделения эндонуклеазы рестрикции ара 1

 

Изобретение относится к микробиологии и генной инженерии, в частности к получению эндонуклеаз рестрикции с высокой степенью очистки, свободных от примесных нуклеаз. Целью изобретения является повышение чистоты и увеличение выхода целевого продукта. Для выделения рестриктазы Ара 1 используется фракционирование клеточного гомогената в двухфазной системе полиэтиленгликоль - декстран в присутствии хлористого натрия. Дальнейшая очисткаферментаосуществляется хроматографией на фосфоцеллюлозе и на гидроксилапатите. Способ позволяет получать 420000 ед.акт/г биомассы высокоочищенного препарата фермента, свободного от примеси неспецифических нуклеаз и фосфатаз, выход по активности составляет 51 %, удельная активность препарата 150000 ед/мг. 5 табл. Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з C12 N 9/14

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4682836/13 (22) 24.04.89 (46) 15.06,91. Бюл.%22 (71) Научно-исследовательский и конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) Т.Н.Гладченко и Ю.П.Зернов (53) 577. 15.07 (088.8) (56) Greene P J., Heyneker Н Л ., ВоНчаг F„

Rodrigues R, et а1., А general method аког the

purification of restriction enzymes. — Nuci.

Acids Res., 1978, v.5, М?, р. 2373 — 2380.

Seurinck J,A„M.Van de Voorde, А new

Restriction endonuclease from Acetobacter

pasterlanus. — Nucl. Acids НезеагсК 1983, ч.11, N. 10, р.4409 — 4415. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ АРА 1 (57) Изобретение относится к микробиологии и генной инженерии, в частности к полИзобретение относится к микробиологии и генной инженерии, в частности к получению эндонуклеаз рестрикции с высокой степенью очистки, свободных от примесных нуклеаз.

Рестриктаза Ара 1 является уникальной, не имеет изошизомеров и, следовательно, не может быть заменена какой-либо рестриктазой из другого источника.

Целью изобретения является повышение чистоты и увеличение выхода целевого продукта.

Способ заключается в том, что для выделения рестриктазы Ара 1 используется фракционирование клеточного гомогената в двухфазной системе ? — 7ь ный полиэтиленгликоль (ПЭГ), 2ь-ный декстран в присутст„„Я „„1655986 А1 учению эндонукпеаз рестрикции с высокой степенью очистки, свободных от примесных нуклеаз. Целью изобретения является повышение чистоты и увеличение выхода цепевого продукта. Дпя выделения рестриктазы

Ара 1 используется фракционирование клеточного гомогената в двухфазной системе полиэтиленгликоль — декстран в присутствии хлористого натрия. Дальнейшая очистка фермента осуществляется хроматографией на фосфоцеппюпозе и на гидроксилапатите, Способ позволяет получать 420000 ед.акт/г биомассы высокоочищенного препарата фермента, свободного от примеси неспецифических нукпеаз и фосфатаз, выход по активности составляет 51, удельная активность препарата 150000 ед/мг. 5 табл, вии определенной (0,6 М) концентрации хлористого натрия, а дальнейшая очистка фермента осуществляется хроматографией на фосфоцеллюлозе Р-11 с элюцией градиентом (0,15 — 1) M хлористого калия в буфере и . хроматографией на гидроксилапатите (ГАП) с элюцией градиентом (0,01; 0,6) M концентрации капийфосфатного буфера рН 7,4. Использование в процессе хроматографий на фосфоцеллюлоэе Р-11 и гидроксилапатите буфера, содержащего определенную (0,1 мМ) концентрацию ЭДТА, ведет к большей стабильности фермента и повышению выхода целевого продукта.

Для фракционирования клеточного гомогената в двухфазной системе ПЭà — декстран оптимальная концентрация NaCI

1655986

15

20 равна 0,55- 0,65 M (табл.1), а ПЭГ и декстрана — 7 и 2 (соответственно (табл.2).

Как видно из табл.2, двухфазная система7 )ь-ный полиэтиленгликоль-2ф,-ныйдекстран является оптимальной. Двухфазная система 4 -ный ПЭГ-7 -ныйдекстран по составу фаз соответствует двухфазной системе 7 -ный ПЭà — 2ф,-ный декстран, но при этом увеличивается объем нижней фазы, что вызывает методические трудности при разделении фаз.

Подбор концентрации ЗДТА в. элюирующих хроматографических буферах позволяет увеличить выход рестриктазы Ара 1 (табл.3).

Иэ табл.3видно,,что использование оптимальной {0,10 — 0,15 мМ) концентрации

ЗДТА значительно увеличивает выход целевого продукта.

В табл,4 представлена зависимость выхода эндонуклеазы рекстрикции Ара 1 от концентрации ЭДТА в хроматографических буферах при выделении по известному способу и согласно изобретению.

Объем градиента на начальных этапах очистки (хроматография на фосфоцеллюлозе) составляет 5-10 объемов хроматографической колонки. При более тонкой очистке (стадия доочистки фермента на гидроксилапатите) объем градиента увеличивают до 15 — 30 объемов колонки. Объемы колонок рассчитывают в зависимости от емкости сорбента и количества наносимого материала, Начальная концентрация соли в градиенте определяется концентрацией соли в буфере. Конечная концентрация соли определяется экспериментальным путем.

Использование крутых градиентов сказывается на эффективности разделения, а применение пологих градиентов приводит к разбавлению фермента, что иллюстрируется данными, представленными в табл.5.

Оптимальными концентрациями градиентов при хроматографической очистке целевого продукта являются при хроматографии на фосфоцеллюлозе 0,15—

1,0 М KCt, и на гидроксилапатите — 0,1 — 0,6

М калийфосфата.

Способ позволяет получить препарат рестриктазы с высоким выходом (табл.4) и очищенный от примесей экзонуклеаз и фосфатаз, тогда как препараты фермента, выделенные по известному способу, содержат примесные экзонуклеазы.

Получение рекстриктазы Ара 1 из

Acetobacter pasteurlanus.

Пример 1. Для получения рестриктазы

Ара 1 используют штамм Acetobacter

Pasteurlanus ВК-440, полученный из Цент25

55 рального Музея промышленных микроорганизмов института ВНИИ генетика.

Все операции по выделению и очистке фермента проводят при +4 С. Активность рестриктазы тестируют методом гидролиза

ДНК фага Л с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом на пластинах с 1 (,-ным агарозным гелем, Для увеличения разрешающей способности электрофореза в агарозном геле используют метод, основанный на периодическом изменении полярности напряжения, подаваемого на электроды электрофоретической камеры (пульсирующий форез). Для разделения Ара 1 рестриктов ДНК фага Л и нативной ДН К фаза Л используется пульсирующее поле с периодом 1, 2 с в прямом и 0,6 с в обратном направлениях. Реакционная смесь для гидролиза содержит 10 мМ трис-HCI рН 7,9; 6 MM MgClg; 6 мМ KCI;

10 MM 2-меркаптоэтанол; 1 мкг ДНК фага

Л и 1 мкл фермента. Реакцию проводят при

37 С 10 мин. Электрофорез проводят в 0,06

М трис-ацетатном буфере, рН 7,9, 2 мМ ЭДТА в течение 5 ч при напряжении 100 В.

Окрашенные этидий-бромидом (1 мкгlмл) гели просматривают в УФ-свете.

За единицу активности принимают количество фермента, которое в оптимальных условиях за 1 ч полностью расщепляет 1 мкг

ДНК фага Л . 2 г биомассы Acetobacter

pasteurlanus суспендируют в 4 мл буфера экстракции, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН 7 5; 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 0,1 мМ

ЭДТА и 0,1 -ный тритон Х-100, обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе при частоте 20 кГц и амплитуде 17 мкм по 30 с 5 раз с интервалом 30с для охлаждения смеси, К 6 мл клеточного гомогената приливают 6 мл смеси 21ф, ПЭà — декстран, 2,7 мл 4

M натрия хлористого и 3,3 мл деионизованной воды (конечная концентрация ингредиентов — 77ь-ный ПЭГ, 27,-ный декстран, 0,6 М NaCI). Смесь перемешивают 15 мин, выдерживают 30 мин в ледяной бане и центрифугируют на центрифуге Bekman С 2- 21 при 8000 об/мин1 ч.

Верхнюю фазу сливают и диализуют против 1 л буфера В, содержащего 10 мМ калий фосфат рН 7,4; 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 0,1 мМ ЭДТА; 10 -ный глицерин. Диализ проводят со сме сой буфера (три раза) в течение 6 ч, Отдиализованную фракцию со скоростью 15 мл/ч наносят на колонку 1,5х30 см с фосфоцеллюлозой Р-11. Колонку промывают 5D мл 0,15 M калия хлористого в буфере. Далее для элюции используют линейный

1655986 градиент концентрации калия хлористого

0,15 — 1,0 M в буфере В объемом 200 мл.

Фракции, элюируемые при 0,35 — 0.45 М KCI и содержащие основную часть активности, объединяют. 5

Ферментный раствор без диалиэа со скоростью 3 мл/ч наносят на колонку 0,9х4 см с гидроксилапатитом. Элюцию проводят линейным градиентом концентрации калия фосфорнокислого рН 7,4 от 0,01 до 0,6 М, 10 содержащего 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА и 10 -ный глицерин. Общий obbем градиента 50 мл. Фракции, элюируемые при 0,22 — 0,28 М соли, содержащие активность рестриктазы Ара 1, объединяют и ди- 15 ализуют против буфера В, содержащего

50 -ный глицерин. Выход рестриктазы Ара.

1 составил 420000 ед,акт./г биомассы, В препарате рестриктазы отсутствуют примеси неспецифических эндонуклеаз (сохране- 20 ние специфической картины рестрикции при инкубации 1 мкг ДНК фага А с 30 ед, акт. фермента в течение

17 ч при 37 С и примеси экзонуклеаз и фосфатаз (фрагменты ДНК, полученные гид- 25 ролизом 1 мкгДНК фага 130 ед.акт,фермента в течение 1 ч при 37 С сшиваются с

ДНК-лигазой и повторно гидролизуются рестриктазой). Концентрированные нрепараты хранят без снижения активности год и 30 более при минус 20 С.

Пример 2. Эндонуклеазу рестрикции

Ара 1 выделяют из 2 г клеток аналогично примеру 1, но к клеточному гомогенату приливают2,5мл 4М йаС1(до конечной концен- 35 трации 0,55 M) и 3,5 мл деионизованной воды. Выход препарата составил 385000 ед.акт./г биомассы.

Примеси неспецифических эндонуклеаз, экзонуклеаз и фосфатаз в препарате не 40 обнаруживаются, Пример 3. Эндонуклеазу рестрикции

Ара 1 выделяют из 2 г биомассы аналогично примеру 1, однако к клеточному гомогенату приливают 2,9 мл 4 M NaCI (до конечной 45 концентрации 0,65 М) и 3,1 мл деионизованной воды, Выход препарата составил

400000 ед.акт./г биомассы.

Примеси неспецифических эндонуклеаз, экзонуклеаз из фосфатаз в препарате не обнаруживаются.

Пример 4. Эндонуклеазу рестрикции

Ара 1 выделяют из 2 г клеток аналогично примеру 1, однако буфер В содержит

0,15 MM ЭДТА. Выход препарата составил

370000 ед.акт./г биомассы.

Примеси неспецифических зндонуклеаз, экзонуклеаз и фосфатаз в препарате не обнаруживаются.

Таким образом, выход рекстриктазы

Ара 1 составляет 420000 ед.акт. с 1 г биомассы, В препарате рестриктазы отсутствуют примеси неспецифических эндонуклеаз (сохранение специфической картины рестрикции при инкубации 1 мкг ДНК фага il с 30 ед. акт. фермента в течение 17 ч при 37 С) и примеси эндонуклеаз и фосфатаз (фрагменты ДНК, полученные гидролизом 1 мкг ДНК фага 30 ед.акт, фермента в течение 1 ч при

37 С сшивзются ДНК-лигазой и повторно гидролизуются рекстриктазой).

Формула изобретения

Способ выделения эндонуклеазы рестрикции Ара 1, включающий разрушение биомассы ультразвуком, фракционирование лизата и хроматографическую очистку. отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты и увеличения выхода целевого продукта, фракцианирование лизата осуществляют в двухфазной системе, содержащей 7 полиэтиленгликоля и 2 декстрана в присутствии 0,55 — 0,65 М NaCI, хроматографическую очистку фермента проводят последовательно методом ионообменной хроматографии на фосфоцеллюлозе P-11 в градиенте KCI 0,15 — 1,0 M u методом адсорбционной хроматографии на гидроксилапатите в градиенте фосфорнокислого калия 0,01 -0,6 M с использованием в элюирующих хроматографических буферах 0,10 — 0,15 мМ ЭДТА.

1655986

Т а б л и и а 1

Фракцноцнрование клеточного гомогената я двухфазной системе

77. ПЭ) -27. декстран при различных концентрациях NaC1

0,1 02 04

Концентрация 0

НаС1,, М

О,05

Наличие Лра 1

++ ++ ++ ++

Наличие примесных нуклсаз

Обнаруживаются следовые количества

Таблица 2

Фракциоцирование клеточного гомогсцатл црн различных концентрациях полиэтиленгликоля и декстрана н присутствии 0,6 М NaC1

ПЭГ, Х

Декстран, Х

Наличие Ара 1

7,0

ll,25

8,3

6,!

5,2

2,4

l,7

3,2

2,0

1,5

++

Таблица

Влияние концентрации ЭДТЛ на выход фермента

) l

1,0

0,,15 0,10

0;05

0,3

ЭДТЛ, мИ

47

17,3

4,3

Выход, Х

Таблица 4

Выделение Ара I иэ 2 г биомассы

1 !

Выход, 7!

Суммарное коВыход, Х

Выход

7 во, ед акт.

«lO мл

«10 3

ПЭГ- ) 64 56 ) 00 декстран

Клеточ- 164 82 ный экI0O

l 68 84

l 00

Клеточный эк стракт стракт

89 Биог ель 1 51 42

А-0 5 см

145 68

Фо с<Ьо150 42

Биогель

Л-0 5 см целлюлоза

P-11

84 150 51

ГАП (0,1 мИ

ЭДТА) 55

ДЭАЗ вЂ” 90 36 целлюлоза (0,1 мИ

ЭДТА) 7>4 ll

18,5

77 150

l 4 4,3

7,2 ()тадии по

Известноь)у способу

ДЭЛЭцеллюлоза (1 мМ

ЭДТЛ) Фосфоцеллюлоза P-I ) (1 мМ

ЭДТЛ) Актив ность ед. ,акт./

/мл

«10

Стадии по известному способу с концйнтрацией ЭДТА

0,1 мМ

Фосфоцеллюлоза

P-l1 (0,1 мИ

ЭДТЛ) Суммар ное количест во, сд акт.

«10

Активность, ед. акт./

/мл «)0

Стадии по предлагаемому способу лич ество, ед. акт./

«10 +

Активность ед. акт./

1655986

cd

Е а3

Ц

Х о

Х о а

Ц

X.>

С>

С>

С>

cd х

Я с4 а о

1 а!

X о а х!

1О о к

Ф к . 4

Q) >О

Ю

С>

С>

Ю

С>

Ф . С>

Ю

Д1

+ О

С>

>>1 в

С>

+ I о

v о

>ГЪ о

Ю

Ф о

Ц

Э

О с

+ 1

Ж 1:>-4

Я . а

1 .о

X о й

>> \

С>

X X:

Х

1 а о и

К

Х о

Р с!

>> о

Е х (О

Х (>!

P О

Х s о к

>g о о а х о х э

3К

Х 6 о >! а

4 к о

Й F

Ж

<>> X ж о

d> а

X X

I

6 дХ!

1 Ж

Щ Я

О X

Ф4 !

° t

Щ

- 1- C> с0 К

<б и

P„

1 а

1 й

1 Ю о

1 Ф.