Способ оценки функционального состояния митохондрий

 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано в научных исследованиях по изучению энергетического метаболизма, а также действия на него лекарственных препаратов. Цель изобретения - повышение точности способа. Способ заключается в измерении показателей функционального состояния митохондрий полярографическим методом у интактных и экспериментальных животных, определении показателя интактности функционального состояния (ИФ) митохондрий по формуле ИФ = Σ A<SB POS="POST">C</SB> <SP POS="POST">.</SP> *98M<SB POS="POST">I</SB> ( X<SB POS="POST">I</SB>), где A<SB POS="POST">I</SB> - весовой коэффициент каждого из показателей

μ<SB POS="POST">I</SB> (X<SB POS="POST">I</SB>) - степень принадлежности значения каждого показателя X опытных митохондрий терму, соответствующему значениям данного показателя интактных митохондрий

значение коэффициента в интервале 0,5 - 1,0 свидетельствует о принадлежности функционального состояния исследуемых митохондрий к диапазону физиологических реакций, а в интервале 0 - 0,5 - о наличии патологических изменений функционального состояния митохондрий. 6 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК гя)ю 6 01 N 33/48

ГОСУДАPСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4440674/14 (22) 15.06.88 (46) 07.08.91, Бюл. ¹ 29 (71) Н ауч но-исследо вател ьский институт фармакологии Томского научного центра

AMH СССР и Томский политехнический институт (72) Н.В.Панин, О.П.Панин и В.А.Хазанов (53) 612,015 (088.8) (56) Кондрашова M.Í. — В сб.: Регуляция энергетического обмена и устойчивость организма. — Пущино, 1975, с. 67-81. (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ МИТОХОНДРИЙ (57) Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано в научных исследованиях по изучению энергетического метаболизма, а также дей. ствия на него лекарственных препаратов.

Цель изобретения — повышение точности способа. Способ заключается в измерении

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано в научных исследованиях по изучению энергетического метаболизма, а также действия на него лекарственных препаратов.

Цель изобретения — повышение точности способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Получают митохондрии (МХ) методом дифференциального центрифугирования, затем исследуют дыхание MX полярографически. Среда инкубации: сахароза 0,17 М, КС! 40 мМ, трис-НС! 10 мМ, КНгР04 5 мМ, ЭДТА 0,2 мМ, добавки АДФ по 200 нгат, субстракт окисления — сукцинат 5 мМ или Ж „„1668945 Al показателей функционального состояния митохондрий полярографическим методом у интактных и экспериментальных животных, определении показателя интактности функционального состояния (ИФ) митохондрии по формуле ИФ =, ei уо (Xi). где о в

1=1 весовой коэффициент каждого из показателей; р (Xl) — степень принадлежности значения каждого показателя Х опытных митохондрий терму, соответству ощему значениям данного показателя интактных митохондрий; значение коэффициента в интервале 0,5-1,0 свидетельствует о принадлежности функционального состояния исследуемых митохондрий к диапазону физиологических реакций, а в интервале 00,5 — о наличии патологических изменений функционального состояния митохондрий.

6 табл. сукцинат 5 мМ + а -глицерофосфат 3 мМ +

Р-оксибутират 3 мМ, По полярограмме рассчитывают следующие показатели: Ч4л, Чз, Ч4о, СД, ДК, Тр, АДФ/О, ЧзАк-ЧЗ, где V4q— скорость дыхания МХ в четвертом метаболическом состоянии по Чансу, нгат О /мин мг белка, Чз — скорость фосфорилирующего дыхания, нгат Oz/ мин мг белка; V4o — скорость дыхания в четвертом метаболическом состоянии по Чансу после фосфорилирования, нгат Oz/ мин мг белка; СД вЂ” коэффициент стимуляции дыхания (Чз/Ч4п); ДК вЂ” коэффициент дыхательного контроля (V3/Ч40); Тр— время фосфорилирования, с мг белка;

АДФ/Π— отношение количества профосфорилированного АДФ к количеству потребленного кислорода; ЧзАк-Чз — изменение

1668945

По величине коэффициента ИФ делают вывод о том, что исследуемые митохондрии

45 полностью соответствуют органеллам интактных животных. Полученный результат не противоречит оценке указанных митохондрий с позиций традиционно используемого подхода. Органеллы характеризуются

50 достаточно низкими и сравнимыми скоростями контролируемого дыхания (V4 и

V4o), хорошей реакцией на АДФ (СД =

=3,1), близким к теоретически возможному в условиях окисления сукцината коэффициентом АДФ/О. Умеренное нарастание скорости фосфорилирующего дыхания в ответ на внесение в среду инкубации активаторов сукцинатдегидрогеназы (Чздк-V3 = 3,4) демонстрирует отсутствие нагрузки на систему энергопродукции. Время скорости фосфорилирующего дыхания в ответ на добавку в среду инкубации активаторов сук цинатдегидрогеназы а -глицерофосфата и /3 -оксибутирата, нгат Ор/ мин.мг белка.

На основе полученных в опыте полярографических кривых известными способами расчитывают значения Xi следующих параметров: Ч и, Чз, Ч4о, СД, ДК, Тр, АДФ/О, Чэдк-Чз.

Рассчитывают степень принадлежности,и (Х ) значений Х измеряемых параметров терму интактные митохондрии, значения весовых коэффициентов а для каждого измеряемого параметра, а затем показатель интактности ИФ по формуле ив= (ai pi (xi).

i =1

При значении ИФ 0,5-1,0 функциональное состояние их оценивают как физиологическое, а при значении менее 0,5 — как патологическое.

При расчете ИФ по указанной формуле учитывают следующее, Для каждого I-ro измеряемого параметра методами теории нечетких множеств получают вид функции принадлежности и1(Xi) значений Xi измеряемых параметров терму интактные митохондрии по формуле

1, при MCPI Si

I+(2S (Х-МcP -Sl))AP

I при Xl < МСР— SI, 1

1 + (25 (bcpl Si Xi)) КлеВ

1 при Х1 < MCPI — ЯЬ

1 где Xi — значение измеряемого параметра;

Mcpi — среднее арифметическое i-го параметра в группе интактных животных;

Si — исправленное среднее квадратическое отклонение i-ro параметра в группе интактных животных;

Кпее, Кпр — показатель степени, который задается экспертом, например подбирается в диалоговом режиме работы с вычислительной машиной, для большинства функций принадлежности принята вторая степень.

Весовой коэффициент а рассчитывают по формуле

bi

ai= ,>, Ь|

l 1 где и — число измеряемых параметров Х;;

bi — балл 1-10, присваемый каждому I-му параметру в зависимости от важности этого параметра (баллы присваиваются группой экспертов в процессе диалогового режима работы с вычислительной машиной), Пример 1. Декапитируют интактную крысу, выделяют и исследуют митохондрии мозга согласно указанной методике. Для каждого из восьми параметров дыхательной активности органелл рассчитывают степень принадлежности терму интактные митохондрии. Расчет проводят относительно полученных на достаточно большой выборке средних величин соответствующих показателей (Мер) с учетом их исправленного среднеквадратического отклонения (Si) и весового коэффициента каждого из показателей (а ), рассчитываемого с учетом присвоенных группой экспертов каждому iму параметру балла (bi) отражающего вклад данного параметра в совокупное состояние обьекта, а также показателей степени функции принадлежности измеряемого параметра терму интактные митохондриии (Клев и

Все используемые в расчете величины и полученные результаты приведены в табл. 1, Значение Х (Чз) равно 57,4; Мер (Чз) =

= 58,1; S (Чз) = 1,2, т,е, Мер (Чз) — S (Чз)

<Х (Чз) < М,р (Чз) + S (Чз), так как 58.1-1,2< 57,4 < 58,1 + 1,2, следовательно ,и(Чз) = 1. Указанным образом определяют

pi(Xi) для всех остальных параметров. В примере 1 все они (табл. 1) равны 1.

Далее определяют показатель ИФ: и

ИФ = g ai PI (Xi) =0,03.1+0,19.1+

I =1

+0,03 1+ 0,05 1+ 0,05 1+ 0,14 1+

+ 0,24 1 + 0,27 1 = 1, 1668945

15

5п

55 фосфорилирования добавленной АДФ, ха рактеризующее совместно с коэффициентами АДФ/О, СД и ДК-состояние процессов окислительного фосфорилирования, практически не отличается от такового в интактной группе.

Таким образом, по совокупной оценке полученных данных исследуемые MX находятся в состоянии покоя, хорошо энергизованны, без следов предшествующей гиперактивности, процессы окислительного фосфорилирования полностью сопряжены, что соответствует понятию интактные MX.

Пример 2. Под эфирным наркозом перевязывают крысе обе сонные артерии.

Через восемь часов животное погибает.

Из мозга погибшей крысы выделяют

МХ, исследуют показатели их дыхательной активности. Способам по примеру 1 рассчитывают величину коэффициента ИФ (данные для расчета в табл. 2). Расчет показывает, что величина коэффициента

ИФ у данных MX близка к нулю. ИФ =

=0,03 0,16+ 0,19 0;00+ 0,03 0,00+ 0,05х

x0,00+ 0,05 0,00+ 0,14.0,00+ 0,24 0,00+

+0,27 0,00 = 0,004. Это свидетельствует о наличии в MX тяжелых, несовместимых с жизнью клетки, патологических изменений.

По показателям дыхания органеллы имеют низкую начальную скорость окисления субстрата, извращенную реакцию на внесение в среду АДФ, отсутствие выхода в контролируемое состояние, что характеризует глубокий низкоэнергетический сдвиг, торможение и полное разобщение окислительного фосфорилирования. Полученные данные свидетельствуют о глубоких и необратимых функциональных и органических изменениях в МХ, что согласуется с расчетной величиной коэффициента ИФ, Пример 3. Под эфирным наркозом перевязывают крысе обе сонные артерии.

Через три часа у животного шерсть взъерошена, двигательная активность существенно снижена. Оценка показателей дыхания выделенных МХ мозга (табл. 3) по величине коэффициента ИФ показывает наличие выраженных изменений функционального состояния в диапазоне физиологических, в данном случае компенсаторных, реакций (расчетный показатель входит вдиапазон 0,5-1,0). ИФ =0,03 0,5+0,19 0,5+

+0,05 0,5+0,05 1,0+ 0,14 0,29+0,24 1,0+

+ 0,27 0,07 = 0,500.

МХ данного животного характеризуются достаточно высокими скоростями дыхания, выраженной и правильной направленности реакций на АДФ, отсутствием каких-либо признаков разобщения окислительного фосфорилирования, что свидетельствует об отсутствии органических и глубоких функциональных изменений в MX. Вместе с тем, повышенная по сравнению с интактными MX начальная скорость дыхания, снижающаяся при энергизации после цикла фосфорилирования, сниженная скорость фосфорилизующего дыхания и минимальная, но уже извращенная реакция на активаторы СДГ говорят о наличии в органеллах выраженного низкоэнергетического сдвига в пределах диапазона компенсаторных воэможностей MX.

Пример 4, Под эфирным наркозом перевязывают крысе обе сонные артерии.

Через 3,5 ч наблюдают у животного выраженные проявления церебральной ишемии: сниженная двигательная реакция, бледные глаза, учащенное дыхание, клонические подергивания, переходящие в тонические судороги, слабая реакция на внешние раздражители, Через три часа ишемии крысу декантируют, выделяют и исследуют MX мозга. Для каждого из восьми исследуемых параметров рассчитывают принадлежность терму интактные митохондрии (табл. 4)., 3атем определяют показатель ИФ

ИФ = 0 03 1+ 0,19 О+ 0 03 0,14+

+ 0,05 0,4+ 0,05 0,61+ 0,14 О+

+ 0,24 0,31 + 0,27 0,03 =-. 0,168.

Величина показателя свидетельствует о наличии тяжелых патологических изменений в MX. Традиционная трактовка результатов указывает на проявление глубокого низкоэнергетического сдвига (снижение величины АДФ/О, Тр, Чз, извращенная реакция на активаторы СД1). Однако

MX несмотря на выраженное и прогрессирущее снижение компенсаторных реакций (1/4о > Vp„) способны сохранять энергетический гомеатаз, поддерживать на минимальном уровне энергозависимые процессы. Видно, что расчетная величина коэффициента ИФ хорошо согласуется с имеющимися в MX патологическими изменениями. . Пример 5. 3а 30 мин до перевязки обеих сонных артерий вводят крысе антигипоксант бемитил (50 мг/кг внутрибрюшинно). К третьему часу ишемии животное на фоне некоторой общей заторможенности сохраняет активные двигательные реакции. Все внешние признаки выраженной церебральной ишемии отсутствуют, Оценка состояния МХ мозга по показателям дыхательной активности (табл. 5) с последующим расчетом величины коэффициента

ИФ =0,03 1+0,19 0,2+0,03 0,37+

+ 0,05 0,97 + 0,05 1 + 0,14 0,99 +

< 0,24 1 + 0,27 0,79 = 0,773 свидетельствует о наличии изменений функционального состояния MX в диапазоне физиологических компенсаторных реакций, Судя по показателям дыхания MX наблюдаются начальные явления низкоэнергетического сдвига (увеличение— незначительное повышение V

Пример 6. Под эфирным наркозом перевязывают крысе обе сонные артерии, К третьему часу ишемии у животного наблюдаются внешние признаки циркуляторной гипоксии — учащенное дыхание, взъерошенная шерсть, сниженная двигательная активность, но у данной особи отсутствуют проявления, характерные для глубокой ишемизации мозга развития судорожной активности, Исследование MX мозга крысы с последующим расчетом величины коэффициента ИФ (табл. 6) указывает наличие патологических изменеHMA.

Г!

ИФ = 0,03 0,55+ 0,19 .0,19+ 0,03 0,37+

+0,05 0,48+0,05 1+0,14 0,1+

+ 0,24 1 + 0,27 0,07 = 0,41.

Оценка состояния органелл также указывает на наличие выраженного низкоэнергетического сдвига, нарастак>щих явлений ингибирования СДГ, торможения процессов окислительного фосфорипип вания, Однако в отличие от примера 4, где

ИФ =- 0,168, у животного тяжелая ишемия с судорожными припадками, не наблюдают столь выраженного разобщения окисли5 тельного фосфорилирования (АДФ/О = 1,8 и 1,5 соответственно) и повышение его времени (Тр =- 120,0 и 219,0 соответственно).

В то же время проявления низкоэнергетического сдвига более яркие по сравнению

10 с примером 3, где у такого же ишемизированного животного ИФ = 0,500, в частности ниже коэффициент АДФ/О, дольше время фосфорилирования, несколько ни.же скорость фосфорилирующего дыхания

15 и величина коэффициентов СД и ДК, По анализу показателей дыхательной активности.МХ в данном примере имеется больший низкоэнергетический сдвиг, чем в примере 4, 20 Таким образом, предлагаемый способ позволяет с высокой точностью определить функциональное состояние MX.

25 Формула изобретения

Способ оценки функционального состояния митохондрий, включающий полярографическое определение скоростей дыхания до, после и во время фосфорили30 рования и времени фосфорилирования в контрольных и опытных митохондриях, отл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа, дополнительно определяют коэффициент стимуля35 ции дыхания и дыхательного контроля, отношение АДФ/О и разность скоростей дыхания во время фосфорилирования в присутствии и отсутствии активатора сукцинатдегидрогеназы, затем рассчитывают

40 показатель интактности ИФ по формуле иэ = g a, p, Ix,).

l=i где ai — весовой коэффициент каждого из показателей;

pt(Xi) — степень принадлежности значения каждого показателя Х опытных митохондрий терму, соответствующему значениям данного показателя интактных митохондрий; и при значении ИФ = 0,5-1,0 функциональное состояние митохондрий оценивают как физиологическое, а при ИФ< 0,5 — как патологическое.

1668945

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

1668945

Таблица 5

Таблица 6

Составитель Н. Гуляева

Техред M.Моргентал Корректор Т. Палий

Редактор И. Шулла

Производственно-иэдательсvнй I .Oìáèíàò "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2653 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5