Способ определения размеров циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в клинической и теоретической иммунологии для определения иммунных комплексов в сыворотке крови. Целью изобретения является повышение точности определения крупных иммунных комплексов, их относительного количества и размеров. Цель достигается тем, что осаждение макромолекулярных структур производят раствором полиэтиленгликоля в конечной концентрации 0,1 - 0,5%, регистрацию осуществляют по измерению спектра оптического смешения света, рассеянного пробой до и после осаждения. Размеры макромолекулярных структур определяют по их гидродинамическому радиусу. О количестве крупных иммунных комплексов судят по изменению оптической плотности раствора. 5 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК тятю 6 01 N 33/535
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТГНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4450179/14 (22) 28.06.88 (46) 30.08,91. Бюл. ¹ 32 (71) 1-й Ленинградский медицинский институт им. акад. И.П,Павлова (72) А.А.Яковлев, А.М.Яковлев, Е.Ю.Карзова и С.М.Балабанов (53) 612,015(088.81 (56) I,lmmunol. Methods, 1977, vol, 16, N 2, р,165-183. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗМЕРА
ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (57) Изобретние относится к медицине и может быть использовано в клинической и теоретической иммунологии для определения
Изобретение относится к медицине, иммунологии и может быть использовано при изучении патогенеза различных заболеваний.
Цель изобретения — повышение точности способа и обеспечение воэможности одновременно регистрировать распределение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) по размерам.
Целк достигается тем, что согласно известному способу определения размеров
ЦИК в сыворотке коови путем их осаждения и последующей регистрации осаждение макромолекулярных структур производят раствором ПЭГ 6000 в конечной концентрации 0,1-0,50 . а регистрацию осуществляют измерением спектра оптического смещения света (СОСС), рассеянного пробой до и после осаждения, причем размеры макромолекулярных структур определяют по их гидродинамическому радиусу, а о количест„„Я.1 „„1673972 А1 имллунных комплексов в сыворотке крови.
Целью изобретения является повышение точности определения крупных иммунных комплексов, их относительного количества и размеров, Цель достигается тем, что осаждение макромолекулярных структур производят раствором полиэтиленгликоля в конечной концентрации 0,1 — 0,5, регистрацию осуществляют по измерению спектра оптического смешения света, рассеянного пробой до и после осаждения, Размеры макромолекулярных структур определяют по их гидродинами".ескому рад усу. О ко личестве крупных иммунных комплексов судят по изменению оптической плотности раствора. 5 табл. ве крупных ЦИК судят по изменению их относительного вклада в рассеивание света и изменению оптической плотности раствора, Способ осуществляют следующим образом, К исследуемой сыворотке крови добавляют раствор ПЭГ 6000 в количестве, эквивалентном количеству исследуемой сыворотки (в данном случае 0,2 мл), с тем. чтобы конечная концентрация ПЭГ составила 0,1-0,5, После добавления ПЭГ сыворотку оставляют на 24 ч при 22-24 С, затем исследуемые образцы t, åíòðèôóãèруют .три 6000 об/мин в тече лие 30 мин, После центрифугиоован я суперматант разводят 0,9", -ным физиологическим раствором в 25 раз и помещают исследуемую жидкость в KcAM4pстве 0,5 мl в кювету, Сравнение производят с с.ывороткой крови, к которой вместо ПЭГ 6000 добавляют
1673972
55 такое же количество (0,2 мл) физиологического раствора, после чего также выдерживают 24 ч при 22 — 24 С, центрифугируют при
6000 об/мин 30 мин и разводят супернатант в 25 раз, После этого помещают раствор в количестве 0,5 мл во вторую кювету, Измеряют СОСС по гетеродинной схеме и по полученным гистрограммам раствора беэ ПЭГ и с ПЭГ, сравнивая их, определяют изменение относительного вклада крупной компоненты, а также следят за степенью агрегационных изменений в растворе под действием ПЭГ. Одновременно определяют средний размер по системе (гидродинамический радиус) этой крупной компоненты, по которому можно судить о размере крупных ЦИК, и проводят измерение оптической плотности раствора по известному способу для количественной характеристики содержания крупных ЦИК в сыворотке крови.
П р и м р. р 1. Иэ 4-х больных хроническим активным гепатитом крупные ЦИК размером 3500 нм с относительным вкладом в рассеивание света 30 в количестве, соответствующем 150 ед. оптической плотности (ОП), были обнаружены только у одного больного, причем именно у этого больного отмечалось наиболее тяжелое течение заболевания. В то же время контрольное применение известного метода определения ЦИК выявило лишь незначительную разницу в ОП растворов. Данные приведены в табл.1.
Пример 2, Установлено, что при использовании раствора ПЭГ 6000 в конечной концентрации 0,1-0,5 осаждаются именно крупные ЦИК, не внося значимых изменений в исследумый образец.
Распределение белковых частиц в сыворотке крови по размерам и относительному вкладу s рассеивание света, в зависимости от применяемой концентрации ПЭГ 6000, у больного хроническим гепатитом приведено в табл,2.
Как видно из табл.2, начиная с концентрации ПЭГ 6000 1, вновь увеличивается вклад крупных частиц. Минимальные изменения в составе частиц, позволяющие выделить крупные ЦИК, наблюдаются при применении концентрации ПЭГ 6000 0,1—
0,5
Отсутствие значительных возмущений в сыворотке крови при применении концентрации ПЭГ 6000 0,1-0,5 контролировали не только по изменению вклада частиц в рассеивание света, но и путем определения общего содержания белка, отдельных фракций и содержания основных классов иммуноглобулинов.
Общее содержание белка в надосадке в зависимости от применяемой концентрации ПЭГ 6000 приведено в табл.3.
Содержание иммуноглобулинов класса
А, М, G в надосадке в зависимости от применяемой концентрации ПЭГ 6000 приведено в табл.4.
Как видно иэ приведенных данных, минимальные изменения наблюдаются при концентрации ПЭГ 6000 0,02 — 0.5, в то время как дальнейшее увеличение концентрации ПЭГ 6000 приводит к значительному изменению количественных соотношений как иммуноглобулинов, так и общего белка
Изменение ОП растворов в зависимости от применяемой концентрации ПЭГ
6000 приведено в табл.5, При определении ОП раствора при использовании высоких концентраций ПЭГ
6000 изменение ОП происходит за счет изменения общего количества белка (см. табл,3), При исследовании 100 проб от больных хроническим вирусным гепатитом по изветному способу ЦИК были обнаружены у 90 больных, причем их уровень в сыворотке крови составлял в среднем 0,184+0,04 ед.
ОП. В то же время предлагаемый способ позволял установить, что крупные иммунные комплексы отмечались в 53 больных и их уровень был 0,147+4,01 ед. ОП, в то время как у остальных 37 больных в сыворотке крови выявлялись только мелкие и средние комплексы. Таким образом, известный способ уступает предлагаемому в выявлении крупных ЦИК, играющих ведущую роль в патогенетическом процессе.
В исследуемых осадках определяли структуры с гидродинамическим радиусом с размерами от 5550 до 617 нм, ошибка измерения 1,5 в различных соотношениях, в среднем 1600 200 нм, Формула изобретения
Способ определения размеров циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови путем обработки полиэтиленгликолем 6000, отделения супернатанта с последующей регистрацией, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения точности способа и обеспечения возможности одновременно регистрировать распределение циркулирующих иммунных комплексов по размерам, для обработки используют полиэтиленгликоль в конечной концентрации 0,1-0.5 / в эквивалентном по объему соотношении, обработку проводят
1673972
Таблица 1
Таблица 2
Таблица 3
Таблица 4
Донор
24 ч, а затем отделяют супернатант, регистрацию проводят путем измерения спектра смещения света, рассеянного пробой до и после обработки, с одновременной регистП р и м е ч а н и е. Ошибка метода +0 25 г/л. рацией оптической плотности раствора, при этом в качестве пробы сравнения используют сыворотку крови, обработанную физиологическим раствором. t,08
1,08 ) 1
1,19
1.02
0,64
1673972
Таблица 5
Составитель А. Агуреев
Техред М,Моргентал Корректор Э, Лончакова
Редактор А, Огар
Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101
Заказ 2915 Тираж 390 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35. Раушская наб.. 4/5
