Способ определения потенциальной урожайности линий кукурузы

 

Изобретение относится к области генетико-селекционных исследований и селекционной практики и может быть использовано в селекционных и любых других учреждениях биологического или сельскохозяйственного профиля для определения величины урожайности зерна у селекционных форм, полученных методами половой гибридизации, мутагенеза, сомаклонального варьирования, генетической и клеточной инженерии. Цель изобретения - повышение точности способа. Получают фракцию изолированных митохондрий из проростков исследуемых генотипов и измеряют кинетику синтеза ДНК. Сравнивают ее с кинетикой синтеза ДНК генотипа-стандарта, при этом данный показатель связан с потенциальной урожайностью положительной корреляционной связью.

Изобретение относится к генетико-селекционным исследованиям и селекционной практике и может быть использовано в селекционных и любых других учреждениях биологического или сельскохозяйственного профиля для определения величины урожайности зерна у селекционных форм, полученных методами половой гибридизации, мутагенеза, сомаклонального варьирования, генетической и клеточной инженерии. Цель изобретения - повышение точности способа. Способ основан на существовании достоверных различий в величине скорости синтеза митохондриальной ДНК (мтДНК) в митохондриях генотипов с разной урожайностью зерна: величина скорости синтеза мтДНК в изолированных митохондриях двух- и трехдневных этилированных проростков связана положительной корреляционной связью с величиной урожайности зерна (в ц/га) данного растительного генотипа. Сущность предлагаемого способа состоит в регистрации в условиях in vitro скорости синтеза мтДНК в митохондриях исследуемого генотипа и нескольких стандартных генотипов с известной урожайностью, используемых для построения экспериментальной калибровочной кривой "Скорость синтеза мтДНК - урожайность зерна". Использование калибровочной кривой, графически отражающей характер связи между интенсивностью синтеза ДНК в митохондриях и величиной урожайности зерна, позволяет с необходимой точностью определять графическим способом величину потенциальной урожайности (в ц/га) у исследуемого генотипа. П р и м е р 1. Семена кукурузных линий В84 зак Т (испытываемый генотип) и Cr 25 O2/O2B73 зак Т. А344 sin/sin. W64A (стандартные генотипы) проращивают в термостате на влажной фильтровальной бумаге. Колеоптили двух- или трехдневных этиолированных проростков этих линий в количестве 20 г срезают и используют для выделения митохондрий методом дифференциального центрифугирования. Для этого срезанные побеги кукурузы помещают в предварительно охлажденный стакан гемогенизатора, заливают ледяной средой выделения (соотношение навески побегов и среды 1: 4) и быстро измельчают ножницами. Растительная ткань с помощью пресса продавливается через небольшие отверстия в поршне гомогенизатора (диаметр отверстий 0,5 мм). Среда выделения содержит сахарозу (0,3 М), КН₂РО₄ (0,018 М, рН 7,2); ЭДТА (0,005 М), KCl (0,010 М), MgCl₂ (0,001 М), меркаптоэтанол (0,010 М). Гомогенат фильтруют через капроновую ткань и центрифугируют при 2000xg в течение 3 мин. Осадок отбрасывают, надосадочную жидкость центрифугируют 3 мин при 20000xg. Полученный осадок митохондрий тщательно промывают в 4 мл среды выделения, из состава которой исключен меркаптоэтанол (среда промывания). Время промывания составляет 3 мин. Среда промывания содержит дополнительно бычий сывороточный альбумин (10 мг/мл). Промытые митохондрии осаждают центрифугированием при 20000xg в течение 3 мин. Митохондриальный осадок ресуспендируют в 0,6 мл среды, содержащий 50 мМ трис- HCl/pH 7,4), 20 мМ Na₂HPO₄ 20 мМ сукцината натрия, 4 мМ KCl, 0,5 мМ АТФ, 7 мМ MgCl₂ , 68 мМ сахарозы. После ресуспендирования добавляют 4 мкМ радиоактивного предшественника синтеза ДНК, в качестве которого используют [³Н] - дАТФ (удельная радиоактивность 790 ТБк/моль), и по 15 мкМ остальных дезоксинуклеозидтрифосфатов (дГТФ, дЦТФ, ТГФ). Пробы инкубируют в термостате при 30^оС в течение 20 мин. Через каждые 5 мин из инкубационной среды отбирают аликвоты по 50 мкл, наносят на диски из хроматографической бумаги Whatman N 3 и фиксируют в охлажденном 10% -ном растворе трихлоруксусной кислоты (ТХУ) не менее 10 мин. Затем фильтры дважды промывают 10% -ным раствором ТХУ, дважды 5% -ным раствором ТХУ, многократно отмывают этанолом, высушивают и помещают во флаконы с 2 мл сцинтилляционного раствора, содержащего 6 г РРО, 800 мг РОРОР и 60 г нафталина на 1 л диоксана. Радиоактивность проб измеряют с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика радиоактивности. Скорость синтеза ДНК в митохондриях выражают в тысячах импульсов за 1 мин на 1 мг белка. Результаты определения скорости синтеза мтДНК для четырех стандартных генотипов с известной урожайностью используют для построения кривой, отражающей зависимость "Урожайность - скорость синтеза мтДНК". Коэффициент корреляции ( ρ ), рассчитанный стандартным способом для данного набора генотипов составляет 0,92. С использованием построенной с помощью метода наименьших квадратов калибровочной кривой можно графическим способом определить потенциальную урожайность исследуемого генотипа. Определенная таким способом величина урожайности для испытываемого генотипа (линия В84 закТ) составляет 15 ц/га. Продуктивность испытываемого генотипа в полевом эксперименте составила 14,3 ц/га, что дает хорошее совпадение с результатом, полученным с помощью заявляемого решения. (56) Авторское свидетельство СССР N 1543576, кл. А 01 Н 1/04, 1988.

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ УРОЖАЙНОСТИ ЛИНИЙ КУКУРУЗЫ, включающий получение фракции изолированных митохондрий из проростков и измерение кинетически синтеза нуклеиновых кислот, по которой судят по сравнению с генотипом-стандартом и потенциальной урожайности, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, измеряют кинетику синтеза ДНК.