Способ получения штаммов возбудителя чумы с hfr - свойствами

 

Изобретение относится к микробиологии , в частности к генетике возбудителя чумы , и может быть использовано для получения Hfr-доноров возбудителя. Целью изобретения является повышение частоты образования Hfr-штаммов. Способ заключается в том, что плазмиду F lacj Tn вводят в бактериальные клетки, содержащие плазмиду кальцийзависимости (pCad). Трансконыогантывыращиваютна магн иево-аксалатном агаре, приготовленном на основе среды Эндо. Отбор кланов с Н(г свойствами осуществляют по сочетанию признаков кальцийзависимости и способности сбраживать лактозу и последующей проверкой на перекос хромосомных маркеров в спот-тесте. Эффективность способа 100%, в расчете на выделенные Cad ас+-клоны. 6

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧГСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 15/01

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4693568/13 (22) 18.05.89 (46) 07,10.91. Бюл. N. 37 (71) Всесоюзный научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" (72) В.В.Кутырев, А,А.Филиппов и О.А.Проценко (53) 577.2(088,8) (56) J ohn sc n S.R. Rom lg 1/у. К;

Transposonfacilited гесопзЫпат1оп in Vibrio

cholerae, — Mol Gen. Genet, 1979, v. 170, N 1, р. 93-101.

Кутырев В.В., Проценко О,А., Анисимов

П.И. Создание штамма чумного микроба, обладающего свойствами эффективного донора. — Мол. генетика, 1984, М 4, с. 3-7.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к генетике возбудителя чумы, и может быть использовано для получения Hfr-доноров возбудителя, Целью изобретения является повышение частоты образования Hfr-штаммов.

Способ заключается в том, что в бактериальные клетки вводят гетерологичную коньюгативную плазмиду F lac. Tn, трансконьюганты рассевают до изолированных клонов и отбира1от клоны, имеющие Hfr-доноров, однако при этом в качестве реципиентов F lac.".Tn используют штаммы возбудителя чумы, несущие плазмиду кальцийэависимости (pCad), в качестве селективной среды для отбора Hfr-доноров—

„„5Q „„1682392А1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММОВ

ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ С HFR-СВОЙСТВА-.

МИ (57) Изобретение относится к микробиологии, в частности к генетике возбудителя чумы, и может быть использовано для получения Hfr-доноров возбудителя. Целью изобретения является повышение частоты образования Hfr-штаммов. Способ заключается в том, что плазмиду F lac;:.Тп вводят в бактериальные клетки, содержащие плазмиду кальцийзависимости (pCad). Трансконьюганты выращивают на магниево-аксалатном агаре, приготовленном на основе среды Энда, Отбор кланов с

Hfr-.ñâîéñòâàìè осуществляют по сочетанию признаков кальцийзависимости и способности сбраживать лактозу и последующей проверкой на перекос хромосомных маркеров в спот-тесте. Эффективность способа 100$, в расчете на выделенные Cad+Lac+-клоны. магниево-оксалатный агар на основе среды

Эндо и отбирают клоны с сочетанием признака кальцийзависимости (Cad ) и способности сбраживать лактоэу (Lac ).

Плазмида pCad J.pestls, играющая большую функцию в обеспечении свойства вирулентности, детерминирует, наряду с другими признаками, зависимость роста клеток от ионов Са2+ при 37 С. Клоны, несущие pCad, не способны расти на магниевооксалатном агаре, дефектном по содержанию ионов. кальция, при указанной температуре, но вырастают при 28 С.

Плаэмида pCad возбудителя чумы несовместима с коньюгативными плазмидами

1682392 группы Incii, в том числе F lac:;Tn. При

+ передаче последней штамму pCad наблюдается выраженная элиминация как резидентной,так и, . в особенности, введенной плазмиды (при,раэдельном нахождении в 5 клетках возбудителя оба репликона сохраняются достаточно стабильно). О наличии F

lac::Tn в клонах судят по устойчивости к хлорамфениколу (в случае Tn9) или канамицу Tn5), а также по способности сбраживать 10 лактозу и, соответственно, по формированию окрашенных колоний на среде Эндо (природные штаммы I.pestls лактозонегативны).

Предлагаемая комбинированная магни- 15 ево-оксалатная среда на основе агара Эндо позволяет одновременно тестировать микробную популяцию по признакам, кодируемым обеими плазмидами. При высеве на нее трансконъюгантов pCad F lac: Tn боль- 20 шинство субклонов (69-91%, в среднем

77%) кальцийэависимы, не спосооны сбраживать лактозу и несут, по данным последующего скрининг-электрофореза, лишь резидентную плазмиду. Другая эначитель- 25 ная фетотипическая группа (9 — 30%, в среднем 17%) — Cad Lac — обнаруживает лишь фракцию плазмидной ДНК, соответствующую по молекулярной массе Р!ас;Тп.

Кроме того, в каждом опыте выявляется 30 относительно небольшое количество (1—

12% в среднем 5%) субклонов, сохранивших как кальцийзависимость, так и лактозопозитивность (Cad Lac+). Однако электрофоретический анализ показывает наличие у них только одной автономной плазмиды — pCad, что свидетельствует о вероятной интеграции F Iac. Tn с бактериальной хромосомой. Изучение донорной активности позволяет получить генетические доказательства интеграции: практически все тестируемые субклоны обладают свойствами Hfr-доноров. Они осуществляют градиентный перенос хромосомных генов, в ряде случаев — с высокой частотой (до п 10 з) и не передают маркеры F lac, Tn (Lac — признак и устойчивость к соответствующему антибиотику).

Показано, что транспоэоны Тп9 и Тп5 транслоцируются из плазмиды F lac в хромосому возбудителя чумы с черезвычайно высокой частотой — до 100% в расчете на клетку, потерявшую вектор. Таким образом, при передаче Г 1ас .,Тп возбудителю происходит спонтанное формирование транспозонных областей гомологии (на конъюгативной плазмиде и в хромосоме), Далее имеет место гомологичная рекомбинация, приводящая к внедрению F lac. Tn в бактериальную хромосому и образованию

Hfr-доноров. Этот процесс, по видимому также идет с высокой эффективностью, поскольку, по данным изучения популяционного состава трансконъюгантов pCad Е

lac::Tn, доля клонов с интегрированной коньюгативной плазмидой составляет 1—

12%

При совместном нахождении в клетках возбудителя чумы F lac::Òn обычно сохраняется менее стойко, чем р,Cad. Интеграция с хромосомой, вероятно, приводит к повышеI нию стабильности наследования F lac::Tn, что внешне проявляется в возникновении клонов Cad Lac+, Использование комбинированной селективной среды позволяет по сочетанию этих двух фенотипичных признаков целенаправленно, с высокой эффективностью отбирать клоны, несущие вставку конъюгативной плазмиды в хромосому, а следовательно, искомые Hfr-доноры.

Пример. Плазмиду F Iac::Tn9 (F

lac;;Tn ) передают в межродовых конъюгационных скрещиваниях от Escherichia coll

АВ51-ll recA штамму возбудителя чумы, несущему плазмиду кальцийзависимости (например, 1 резбs 358/12).

Для этого 3-часовую культуру донора, выращенную в бульоне Хоттингера (рН?,2) на качалке до концентрации около 10 м.к,/мл, смешивают с ночной бульонной культурой реципиента в соотношении 1:2 и инкубируют при 28 С в течение 3 ч. Коньюгационную смесь высевают на пластинки агара Хоттингера (рН 7,2) с добавлением полимиксина в концентрации 100 ед/мл (контрселективный агент:возбудителю чумы свойственна природная устойчивость к полимиксину), а также антибиотика в соответствии с маркером транспозона — 25 мкгlмл хлорам феникола (в случае Tn9) или канамицина (при использовании Tn5).

Выросшие через трое суток трансконьюганты (отбирают 4 — 5 клонов) после однократного пассажа на селективной среде пересевают петлей на агар Эндо, изучают с помощью скрининг-электрофореза плазмидной ДНК и одновременно высевают на комбинированную магниево-оксалатную среду на основе агара Эндо.

Для ее приготовления к 150 мл горячей среды Эндо (t 50-55 С) добавляют 14 мл 0,25

М Ьксалата натрия, смесь взбалтывают и через 2 — 4 мин вносят 7 мл 0,5 М сульфата или хлорида магния. После перемешивания среда готова к разливу.

Растворы солей стерилизуют автоклавированием при 110 С(0 5 атм) в течение 30 мин.

Каждый клон высевают на 2-3 чашки так, чтобы получить 200-300 изолированных колоний на агарной пластине. Посевы инкуСоставитель С. Бандрин

Редактор Н.Рогулич Техред М,Моргентал Корректор M.. Кучерявая

Заказ 3383 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, К-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, ужгород, ул,Гагарина, 101 бируют двое суток при 37 С, после чего отмечают выросшие колонии кальцийнезависимых субклонов и переносят чашки в термостат при 28 С. Через сутки отмечают доросшие — кальцийзависимые колонии. Из них отбирают лактозопозитивные варианты (около 50 субклонов). отсевают на агар Хоттингера, проверяют на наличие маркера транспоэона, изучают с помощью электрофореза клеточных лизатов и используют в качестве доноров хромосомных генов в спотскрещиваниях со стрептомицино- устойчивыми ауксотрофными мутантами возбудителя чумы.

Использование нескольких независимых нитроэогуанидин- или транспозониндуцированных реципиентов с повреждением одного — двух маркеров позволяет идентифицировать Hfr-штаммы с различными О-пунктами переноса, Ночные бульонные культуры реципиентных штаммов с помощью металлических рапликаторов наносят на поверхность подсушенных чашек с селективной средой (минимальный агар с добавлением стрептомицина в концентрации 100 мкг/мл и.факторов роста в соответствии с природой ауксотрофностью реципиента, исключая питательные вещества, требуемые в результате мутации).

Концентрация аминокислот (в а-форме) и азотистых оснований в среде составляет

10 мкг/мл, тиамина и никотиновой кислоты

1 мкг/мл.

После впитывания в агар на пятна культуры реципиента с помощью таких же репликаторов наносят ночные бульонные культуры предполагаемых Hfr-доноров. Через 3-6 сут отмечают рост рекомбинантов.

Доноры, дающие наибольшее количество колоний рекомбинантов в спот-тестах, излечивают от плазмиды pCad, наличие которой может неблагоприятно сказываться на стабильности Hfr-штамма. С этой целью

Ф 5

40 кул.туры выс,ваю. на магниево-оксалатный агар, отбирают по три кальцийнезависимых субклона и тестируют их с помощью скрининг-электрофореэа. По одному производному, потерявшему рСао, отбирают для дальнейшего изучения в раaâåpíóòûõ скрешиваниях с полиауксотрофными нитраэогуанидининдуцированными мутантами возбудителя чумы.

Преимущество предлагаемого способа заключается режде всего в черезвычайно высокой эффективности (100,, в расчете на изолированный Cad Lac -клон по сравнению с 10 "Х-ной эффективностью известного способа. Способ весьма надежен и позволяет в короткие сроки (примерно в течение трех недель от момента посева J,pestls

pCad для скрещивания с Е.call F làñ::Тп и до учета результатов спот-скрещиваний) целенаправленно получать десятки Нй -доноров с различными сайтами интеграции плазмиды F lac::Tn, в то время как получение Hfrдоноров с помощью известного способа не всегда воспроизводимо ввиду весьма слабого роста возбудителя при 40СС. Способ менее трудоемок, так как в нем отсуствует стадия выращивания возбудителя в бульоне в течение 18 ч.

Формула изобретения

Способ получения штаммов возбудителя чумы с Hfr-свойствами, включающий введение в бактериальные клетки плазмиды Е

lac::Тп, выращивание клеток на средах, содержащих антибиотик, детерминируемый транспоэоном плаэмиды, отбор Hfr-штаммов, сохраняющих плазмидные маркеры, отличающийся тем, что, с целью повышения частоты образования Hfrштаммов, в качестве реципиентов плаэмиды F lac::Тп используют штаммы возбудителя чумы, содержащие плазмиду кальцийзависимости, а.отбирают Hfr-штаммы, сочетающие признаки кальцийзависимости и способность сбраживать лактоэу.